Analyse morphologique des Drosophile Larvaires périphérique dendrites et des axones des neurones sensoriels utilisant mosaïques génétiques
Summary
Les neurones sensoriels de l'arborisation dendritique des<em> Drosophile</em> Larvaires système nerveux périphérique sont des modèles utiles pour élucider la fois générales et spécifiques à chaque classe neurone mécanismes de la différenciation neuronale. Nous présentons un guide pratique pour générer et analyser dendritiques arborisation neurone mosaïques génétique.
Abstract
Développement du système nerveux requiert la spécification correcte de la position du neurone et de l'identité, suivie par le développement des neurones dendritiques précise classe spécifique et le câblage axonal. Récemment, le dendritiques arborisation (DA) des neurones sensoriels de l'Drosophile larvaire du système nerveux périphérique (SNP) sont devenus puissants modèles génétiques dans lesquels d'élucider les mécanismes à la fois générales et spécifiques à chaque classe de la différenciation neuronale. Il ya quatre principales classes de neurones DA (I-IV) 1. Ils sont nommés dans l'ordre croissant de complexité des dendrites tonnelle, et ont de la classe des différences spécifiques dans le contrôle génétique de leur différenciation 2-10. Le DA système sensoriel est un modèle pratique pour étudier les mécanismes moléculaires derrière le contrôle de la morphologie dendritique 11-13 parce que: 1) il peut profiter de l'puissants outils génétiques disponibles chez la drosophile, 2) le neurone DA dendrite tonnelle se propage en seulement deux dimensions sous un article optiquementar des larves cuticule rendant facile à visualiser en haute résolution in vivo, 3) la diversité des classes spécifiques de morphologie dendritique facilite une analyse comparative de trouver des éléments clés contrôlant la formation de simples vs très ramifiées arbres dendritiques, et 4) dendritiques tonnelle stéréotypées formes de neurones DA différents de faciliter les analyses statistiques morphométriques.
DA neurone modifie l'activité de la sortie d'un générateur de pattern de locomotion des larves centrale 14-16. Les différentes classes de neurones DA ont des modalités sensorielles distinctes, et leur activation provoque différentes réactions comportementales 14,16-20. Par ailleurs des classes différentes envoyer des projections axonales stéréotypée dans le système central de la drosophile larvaires nerveux dans la corde nerveuse ventrale (VNC) 21. Ces projections se terminent par des représentations topographiques de deux neurones DA modalité sensorielle et la position dans la paroi du corps du champ dendritique 7,22, 23. Ainsi l'examen des projections axonales DA peut être utilisée pour élucider les mécanismes qui sous-tendent la cartographie topographique 7,22,23, ainsi que le câblage d'un circuit simple de locomotion des larves modulant 14-17.
Nous présentons ici un guide pratique pour générer et analyser les mosaïques génétiques marquant 24 neurones DA via MARCM (Analyse mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible) 1,10,25 et FLP-out 22,26,27 techniques (résumées dans la Fig. 1).
Protocol
Discussion
La Drosophile larvaire DA neurone modèle fournit un excellent système pour étudier les mécanismes génétiques que la morphologie des neurones de contrôle et de la formation des circuits. MARCM est généralement utilisé pour l'étiquetage et pour générer des clones mutants DA neurone. Pour MARCM nous utilisons soit un pan-neural (p. ex Gal4 C155) ou spécifique des neurones DA pilote. L'utilisation d'un pilote pan-neuronal, il est possible d'utiliser directem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le RIKEN pour le financement. Nous remercions également Cagri Yalçin, Caroline Delandre, et Jay Parrish pour les discussions sur les protocoles génétiques et immunohistochimie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| SZX16 fluorescence dissection microscope (with GFPHQ filter) | Olympus | SZX16 | |
| Live Insect Forceps | FST | 26030-10 | |
| 26mm x 76mm depression slide glass | Toshinriko Co. | T8-R004 | |
| Sylgard 184 (or Silpot 184) | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-1524 | This product has proven most effective |
| DPX mounting medium | Sigma | 44581 | |
| Rabbit anti-GFP | Invitrogen | A-11122 | Dilution 1:500 |
| Rat anti-CD8 | Caltag | 5H10 | Dilution 1:200 |
| Mouse anti-CD2 | AbD serotec | MCA443R | Dilution 1:700 |
| Mouse anti-Fasciclin2 | DSHB | 1D4 | Dilution 1:10 |
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