Vår experimentell plan är schematiskt diagrammed i figur 1. 1. Tillväxt och beredning av mänskliga neurala stamceller (NSCs) för transplantation Den EnStem-A cellinje (EMD Millipore) användes i denna studie. NSCs rutinmässigt validerats av tillverkaren för höga nivåer av uttryck av multipotenta markörer nestin och Sox2, och låg nivå uttryck för pluripotenta markör oktober-4, tillsammans med förmågan att skilja i flera neuronala fenotyper och att upprätthålla en normal karyotyp efter flera passager. Under vår tillväxt förhållanden, visas dessa NSCs rikligt uttryck av Sox2 och nestin och behållit sin förmåga att differentiera, som beskrivits tidigare 1. NSCs odlades på poly-L-Ornithine (20 mikrogram / ml) och laminin (5 mikrogram / ml) bestruket vävnadsodling behandlade kolvar. Celler odlades i neurala expansionen medium (Millipore) kompletteras med L-glutamin (2 mm) och grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF, 20 ng / ml). Anhängare monolager av NSCs har passerats varannan dag (1:2) med accutase som dissociation agenten 1. För transplantation studier var NSCs användes vid passager under 10. NSCs var märkt med 5-bromo-2'-deoxiuridin (BrdU) genom att komplettera den tillväxt media med 4 mikroM BrdU tre dagar före transplantation. För att verifiera BrdU märkning index (dvs procent av BrdU positiva celler) var celler pläterade på kammaren diabilder och behandlas för BrdU detektering med hjälp av vanliga immuncytokemiska metoder. Celler som används för transplantation uppvisar rutinmässigt märkning index över 90% 2. Alternativt var transplanterade mänskliga stamceller detekteras med den mänskliga specifika nukleära antigen markör (HuNu) 2. På dagen för transplantation var accutase och neurala media expansionen förvärmda i ett 37 ° C vattenbad. Cellerna placerades i inkubationen medium (neurala expansionen media som innehåller 10 mikroMav Y-27.632) i en timme. Y-27.632 var (ROCK-hämmare, EMD-Calbiochem) används för att förbättra överlevnaden av NSCs efter transplantation. Efter en timme var inkubation medier bort och cellerna behandlades med accutase i 5 minuter. Efter denna korta behandling Tillsätt en motsvarande volym av neurala expansionen media att neutralisera accutase och stam cellerna genom en 70 mikroM cell sil. Räkna celler med en haemocytometer och förbereda 1,0 x 10 5 leva NSCs per mikroliter i injektionsteknik medium (neurala expansionen media som innehåller 10 mikroM av Y-27.632, 40 ng / ml bFGF, 20 ng / ml BDNF). Celler lagrades i neurala expansionen media (som beskrivs i 1.5) och hålls på is fram till tidpunkten för transplantation, och bör användas inom 6 timmar för att minimera celldöd vid långvarig kylrum. 2. Strålbehandling – behandlingsplanering och bestrålning Sederade athymic naken råtta (er) placerades i ett laboratorium magnetkamera i liggande positio n med skallen på den överlägsna slutet (huvudet först). Detta 3 tesla skannern är avsedd för små djur skanningar. Det kan ge utsökta mjukdelar kontrast med hög rumslig upplösning tvärsnitt (axial) bilder. Skanningen fokuserade på skallen regionen och en uppsättning av 22 T2 E60 viktade bilder med 0,8 mm tjocklek bilden genererades. Dessa bilder ger nödvändig information för att identifiera vänster och höger hippocampi i råttans hjärna. Efter MRT (24h), djuren var sederad [anestesi cocktail (ketamin, 30 mg / kg, xylazin, 2,5 mg / kg och acepromazin, 1 mg / kg)] och placeras i en strålbehandling av cancer CT-scanner där en annan tvärsnittsstudie (axiellt) bild volymen genererades. Råttan var placerad i samma eller nära samma position som används för MRI och CT enheten var inställd på att scanna skallen regionen. En studie av 106 CT-bilder med 0,8 mm tjocklek bilden skapades som blev CT dosplanering data. Behandlingsplaneringha "> MRI och CT bilddata överfördes till ECLIPSE (Varian Medical Systems, Palo Alto, Kalifornien) behandlingsplanering programvara via DICOM (Digital-Imaging and Communications in Medicine). ECLIPSE är en sofistikerad och kommersiellt tillgänglig programvara som används inom strålbehandling av cancer för att modellera och design den bästa planen strålbehandling för en patient. Den innehåller information om orgel densitet som utvinns ur CT-bilddata och används för att beräkna fördelningen stråldosen i kroppen. Täck djuret med ett litet kirurgiskt drapera med bara huvudet utsätts för. Placera djuret fast huvudet i stereotaxic ramen (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab) genom att sätta örat barer i yttre hörselgången. Största försiktighet när du glider spetsen på örat baren i hörselgången. Placera framtand baren genom att kroka fast råttan övre framtänder och justera baren höjd till standard referenspunkt, dra sedan åt näsan klämma. Center positionenav huvudet mellan örat barer med minimal rörelse i sidled (± 4 mm) för att uppnå stereotaxic noll. Nästa steg i processen är att bestämma den bestrålning som skall användas. Intensitetsmodulerad strålterapi (IMRT) och volymmässigt-Modulated Arc Therapy (VMAT) i form av RapidArc är 2 hög precision bestrålning tekniker som använder en 6 MV fotonstråle att leverera en stråldos 3-6. Skillnaden mellan dessa tekniker är att IMRT ger en dos med hjälp av flera statiska banor var och en motsvarar en annan riktning men konvergerande på målvolymen mer lämpade för extremt små mål volymer. RapidArc å andra sidan, ger en dos dynamiskt via en eller flera bågar fokuserad på målet regionen (bild 4). Oavsett utsändningsteknik information om måldosen, mål överensstämmelse och begränsningar dosen till kritiska organ måste föras in i dosoptimering fönster i Eclipse. Thans information tillsammans med orgel volymer används för att skräddarsy dosfördelningen, vilket uppnås genom att kontinuerligt variera balken dämpning under bestrålning. När en plan genererades ger ECLIPSE den beräknade dosen överlagras av den axiella, koronalt och sagittal bilder (bild 5) samt i dos-volym histogram (DVH) format (bild 6). Det är på denna punkt när planen måste utvärderas för att avgöra om den är lämplig för leverans eller behöver förbättras. Bestrålning Process När en plan godkändes för leverans, digitalt rekonstruerade röntgenbild (DRR) bilder genererades från CT databehandlingen planering i Eclipse. Dessa är ortogonala bilder viktas på bentätheten för att markera skallen och andra beniga landmärken. Därefter behandlingsplan och DRRs skickats till behandlingsanläggningar leverans datorsystem via DICOM. Leveransen styr en Varian Trilogy Linear Accelerator normally används för strålbehandling av människor. Gaspedalen är utrustad med 120 datorstyrda tunna multileaf kollimatorer (MLC) och en diagnostisk kvalitet röntgen-system ingår i on-board imaging (OBI) system. Detta leveranssystem inlagda Eclipse-specifik information och ändrar därefter kollimator parametrar i gaspedalen för att leverera den planerade dosen. Vid denna tidpunkt råttan var beredd för bestrålning, sederad och täckt med ett papper filt för att hålla den varm. Efter några minuter var råttan, med sin filt men med den exponerade skalle, placeras på den behandling bordet i samma läge som används för att generera datortomografi. Detta är en kritisk steg eftersom lägesnoggrannhet är direkt korrelerad till noggrannhet i dosen. När råttan var placerad på rätt sätt om behandling bordet, är en uppsättning ortogonala röntgen-bilder tagna med trilogin är OBI-system. Dessa är högupplösta bilder som sedermera smält till ECLIPSE genererad DRRs med OBI Image fusion. Den röntgenbilder och DRRs var digitalt matchas med hjälp av programvara som ger information om förändringar tabell som måste göras för att uppnå samverkan registrering av bilder (bild 7). Efter att ha granskat denna information och kontrollera att den resulterande skiftar inte av misstag inte leder till några kollisioner mellan gaspedalen och behandlingen tabellen gäller datorn skift och behandling bordet flyttar automatiskt till önskad position. Vid det här laget börjar bestrålning. Att leverera en 10 Gy dos med ett 6-fält IMRT plan är strålen-i tid ca 10 minuter medan en två-båge RapidArc tar ~ 3 minuter. Efter behandling leveransen är komplett, var råttan bort från behandlingsrummet och tillåtas återhämta sig i en anläggning bur hålls på en värmedyna. 3. Stereotaxic operation för handel inom hippocampus transplantation av mänskliga stamceller Ennimals djurhållning och kirurgisk förberedelse För denna studie, anställd vi två månader gamla ATN råttor som förvärvats från National Cancer Institute (stam 0N01 Cr: NIH-rnu). Djuren hålls i sterila burar och underhållas i en temperatur-och ljus styrs från hinder En miljö med 12-h/12-h ljus / mörker-cykel. Råttor som autoklaveras mat och vatten ad libitum och omsorg har vidtagits för att förhindra infektion i ögat genom att rengöra ögonen varje vecka med Vetropolycin ögonsalva (Västra Medical Supply, Arcadia, CA). För stereotaxic kirurgi, råttor sövda med en ip injektion av anestesi cocktail (ketamin, 30 mg / kg, xylazin, 2,5 mg / kg och acepromazin, 1 mg / kg). Komplett anestesi induceras efter 10-15 minuter och sedering var övervakas med hjälp påtaglig reflex (toe nypa). Om det behövs under operationen, kan 15-20% av den ursprungliga dosen ges för att upprätthålla tillräcklig anestesi. Ta bort päls från topp med hjälp av elektrisk klippare. Cirka200% av kirurgi område bör rakat för att förhindra infektion av hårstrån. Rengör rakat del med providone / jod (3 gånger) följt av 70% alkohol (3 gånger) innan snitt. Stereotaxic operation Stereotaxic instrument (digital bildskärm och ram), mikromotorer borra, torr säng autoklav och controllers bör hållas i ett laminärt flöde huva för att förhindra eventuell infektion vid operation förfarande ATN råttor. En stereotaxic scen med en inbäddad värmedyna kan användas för att hålla djuren varma under operation. Vi använde "Kimberly-Clark SAFESKIN lila Nitril Sterila undersökningshandskar" thoughout operationen. Dessa handskar är individuellt förpackade i sterila påse (kat. nr. 55.093). Dessutom använde kirurg 70% alkohol spray för att sterilisera händer under operationen. Täck djuret med ett litet kirurgiskt drapera med bara huvudet utsätts för. Placera djuret fast huvudet i stereotaxic ramen (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab) genom att sätta örat bars i Yttre hörselgången. Största försiktighet när du glider spetsen på örat baren i hörselgången. Placera framtand baren genom att kroka fast råttan övre framtänder och justera baren höjd till standard referenspunkt, dra sedan åt näsan klämma. Centrera position huvudet mellan örat barer med minimal rörelse i sidled (± 4 mm) för att uppnå stereotaxic noll. Efter dessa positionering steg, tillämpar smörjande ögonsalva för att förhindra uttorkning och skydda dem från eventuella jod eller spill alkohol. Använd denna salva minst 2 gånger under operation. Gör mittlinjen hud snitt (2 cm) längs hårbotten med hjälp av steril skalpell, och ren med steril bomull tippas applikatorn. Undvik skador i stjärt-och nackmuskler områden. Genom att använda dissekera upprullningsdon, håll periostet öppen och tydlig mjuk vävnad med hjälp av bomull tippas applikatorn doppat i 1% väteperoxid (görs i PBS). För att stoppa blödningen, upprätthålla fast tryck i minst 1 kmn med hjälp av bomull tippas applikator eller gasväv. Applicera fast skrapning rörelse för att rengöra skallen och dutta förslag till huden tills skallens suturer var bregma och lambda synliga. Exakt stereotaxic koordinater, refererade till bregma, fastställdes med råttan hjärnan atlas 7. Stamcellstransplantation gjordes på fyra olika platser för varje hemisfär med följande stereotaxic koordinater: Anterio-posterior (AP) 3,0 mm från bregma, medio-laterala (ML) 1,8 mm från mittlinjen och Dorso-ventrala (DV) 3,2 mm från ytan av hjärnan. AP, 3,6 mm, ML, 2,5 mm, DV, 3,2 mm AP, 4,2 mm, ML, 3,2 mm, DV, 3,2 mm AP, 4,2 mm, ML, 3,2 mm, DV, 3,2 mm När bregma har identifierats, bör alla tre koordinater (AP, ML och DV) nollställas på den digitala displayen / controller (på digitala stereotaxic ram). Fortsätt sedan att markera den exakta transplantation platser (med ovanstående koordinater) Med en fin spets tuschpenna fäst en liten sond hållare på ramen. Borra ett 0,35 mm hål (nr 1 / 4 tandvård Burr, hårdmetall vanadin borr) genom skallen med fotpedalen kontrollerade mikromotorer borra (Leica-myNeurolab). Var noga med att undvika skador på dura membranet. Om blödning uppstår under borrningen, tillämpa fast tryck med hjälp av bomull tippas applikatorn. Applicera inte alkohol eller jod vid borrplatsen, eftersom detta kommer orsaka irritation för djuret. Råttor fick bilaterala inom hippocampus injektioner av en suspension av NSCs injiceras i en maximal volym av 1 mikroliter med en 5 mikroliter Hamilton mikrosprutan (30 gauge). Det exakta antalet celler i denna volym kommer att variera beroende på experimentell detaljerna. För att åstadkomma detta var mikrosprutan fäst en liten sond hållare på stereotaxic ram. Försiktigt in nålspetsen i skallen tills de når ytan av hjärnan (dvs meningerna). Vid denna punkt, DV-samordningTe ska nollställas på den digitala displayen / controller, sedan försiktigt in nålen till önskat djup (DV, 3,2 mm). Vänta 1 minut innan någon injektion av celler. Injicera 0,25 mikroliter volym / min (långsam frisättning) med hjälp av en timer. När totalt 1 mikroliter injiceras, vänta 8 min innan återgång nålen från transplantation webbplats. Efter denna tid, långsamt dra tillbaka nålen från transplantation webbplats (0,5 mm / min) för att förhindra kapillär återflöde av injektionen innehållet tillbaka genom nålen spår. Följ steg 3,2 (JK) för resterande transplantation platser (4 per halvklotet). Ta bort skinnet upprullningsdonet från skallen och använda trubbig pincett för att försiktigt dra tillbaka indragen hud och applicera 4-5 sterila rostfria videoklipp med Autoclips kirurgiska suturer applier (Leica-myNeurolab). Efter att djuret från ramen, injicera med smärtstillande (Buprenorphin, 0,1 mg / kg, SC, varje 12h) och Ringer-laktat lösning (5 mL/250 g vuxen råtta, sc). Placera djuret tillbaka i sin bur som bör hållas på en värmedyna. Övervaka djuret tills det blir medvetna innan han återvänder till sitt innehav rum. Placera en fuktad pellets (djur chow) och transgel i en separat petriskål i varje djur bur. Alternativt kan DietGel Recovery (ClearH 2 O, Portland, ME) användas som en källa av vatten och näringsämnen. Övervaka djur under sin återhämtning tid och tillämpa analgesi (buprenorfin 0,02 mg / kg (varje 12h för 2 dagar). Kolla efter tecken på smärta, rodnad eller infektion i kirurgi webbplats. Applicera providone / jod eller Neosporin salva en gång dagligen (till 2 -3 dagar) för att förhindra eventuella infektioner. Om några tecken på infektion, smärta eller obehag kvarstår efter smärtstillande eller antibiotika inom 12 timmar efter kirurgi, kontakta veterinär eller djur vårdpersonal för ytterligare hjälp. 4. Representativa resultat: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> Figur 1. Schematisk representation av våra experimentella plan. Figur 2. Fusion på CT (beniga anatomi) och MRI (mjukdelar) bilder inom ECLIPSE mjukvaran. Matchning av axial, koronalt och sagittalt sektioner möjliggöra samtidig registret av de kritiska anatomiska funktioner i råtta hjärnan härrör från varje avbildning modalitet. Figur 3. Konturformad hippocampus regioner i hjärnan. Efter bilden fusion omfattas hippocampi och hjärna exklusive hippocampi identifieras och skålade axiellt definiera specifika volymetrisk regioner för dessa organ. Dessa regioner ger anatomiska och volym information som behövs för att justera dosen distribution till det önskade målet (s). ure 4 "src =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> Figur 4. Hög precision bestrålning alternativ med intensitetsmodulerad strålterapi (IMRT) eller volymmässigt-Modulated Arc Therapy (VMAT) i form av RapidArc. Dessa tekniker ger 6 MV fotonen balkar antingen som multipla statiska banor som kan konvergera på mycket små mål volymer (IMRT), eller dynamiskt som en eller flera bågar fokuserad på målet regionen (RapidArc). Figur 5. ECLIPSE beräknas doser överlagras av den axiella bilder. Visas doser är för enkel eller dubbel hippocampi planer bestrålning. Figur 6. ECLIPSE beräknad dos-volym histogram. Data kontraster i procent av de bestrålade kontra den icke-bestrålade hippocampus volym under samma hippocAmpus behandlingsplan visas i bild. 5. Figur 7. Bildstyrd råtta positionering för strålbehandling. Ortogonal digitalt rekonstruerade röntgenbild (DRR) bilder genereras från CT-data som behandlingsplanering i Eclipse är smält till ortogonala röntgenbilder av råttan på behandlingsbordet tas med trilogin on-board imaging (OBI) system. Den DRRs viktas på bentätheten som belyser skallen och andra beniga landmärken som underlättar samarbetet registrering hos OBI bilderna. Matchning av dessa uppsättningar ge behandling skift tabell som måste göras för att uppnå samtidig registrering av CT och röntgen bilder. Figur 8. Placering av transplanterade NSCs efter stereotaxic operation. På en månad efter transplantation var djuren perfusion var hjärnor sectioned och färgas med BrdU (för att upptäcka transplanterade NSCs) och motverka färgad med hematoxylin. Nålen spår (NT, röd linje), visar injektion bana som deponeras NSCs vid transplantationen-utsättningsplatsen (TR), strax nedanför corpus callosum (CC) och över CA1. Transplanterade NSCs visade en omfattande migration från Tr hela värd hippocampus (dentate gyrus, GD, dentate hilus, DH, CA1 och CA3 delområden; förstoring x4). Skala bar, 200 ìm.
