Обнаружение модификации гистонов в листьях растений
Summary
Надежный и полезный подход для обнаружения модификации гистонов на конкретных растительных генов описано. Подход сочетает хроматин иммунопреципитации (чип) и в режиме реального времени количественной ПЦР. Она позволяет обнаруживать модификации гистонов на конкретных генов с роли в различных физиологических процессах.
Abstract
Структуры хроматина имеет важное значение для регуляции экспрессии генов у эукариот. В этом процессе, хроматина, метилирование ДНК, и ковалентных модификаций на аминоконцевого хвостов гистонов H3 и H4 играют существенную роль 1-2. Н3 и Н4 модификации гистонов включают метилирование лизина и аргинина, лизина ацетилирование и фосфорилирование серина остатков 1-2. Эти изменения связаны либо с активации генов, репрессии, или загрунтовать состояние гена, который поддерживает более быстрый и надежный активации выражение после восприятие соответствующих сигналов (микроб связанные молекулярные модели, свет, гормонов и т.д.) 3-7.
Здесь мы представляем метод надежный и чувствительный выявления специфических модификаций хроматина на отдельные гены растений. Методика основана на сшивание (модифицированный) гистонов и ДНК с формальдегидом 8,9, добычей и обработкой ультразвуком хроматина, хроматин иммунопреципитации (чип) с модификацией-специфических антител 9,10, де-сшивки гистонов ДНК-комплексов, а Ген конкретных реальном времени количественной ПЦР. Подход оказался полезным для выявления специфических модификаций гистонов связано с C 4 фотосинтез у кукурузы 5,11 и системного иммунитета у Arabidopsis 3.
Protocol
Discussion
Большинство критических шагов в протоколе сшивки ДНК и гистонов, тип и количество листьев материал, измельчение материала, а ультразвуком хроматина. Для более детального обсуждения этих вопросов см. назв. 9 и 10.
Ультразвуком и сшивания:
Важно, чтобы сорвать хроматина во время обработки ультразвуком с фрагментами о 400bp. Исчерпывающая ультразвуком уничтожит хроматина, разрушая ДНК и гистонов, в то время как недостаточная ультразвуком оставят длинные фрагменты хроматина. Они воздействуют на специфичность метода, так как модификации гистонов дистальных из протестированных локуса не может быть подвергнут дискриминации из локальных изменений. Ультразвука эффективность тестировать, собирая 20 мкл хроматина из образцов до и после обработки ультразвуком, де-сшивающие ДНК и гистонов, изолируя ДНК и определения длины стриженой ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле. РНКазы должны быть добавлены к образцов до электрофореза, потому что хроматина подготовки все еще содержит большое количество РНК на этой стадии очистки, которые могут помешать визуализации фрагментированной ДНК. Образцы полезны для иммунопреципитации хроматина, если ДНК из не-стриженого хроматина длиннее 10kbp, в то время как ДНК из стриженого хроматина формы мазка с максимальной интенсивностью сигнала вокруг 400bp ДНК.
Мы обычно используют 3% (объем / объем) формальдегида для сшивания хроматина в интактных листьях, но 1% (об. / об) формальдегида может быть достаточным в большинстве случаев. В наших руках, низкие концентрации формальдегида позволяют короче ультразвуком раз и фоновых сигналов в последующей реакции ПЦР. Однако, недостаточное количество формальдегида часто приводит к низкой воспроизводимости результатов ПЦР-сигнала между независимых экспериментов. Это может быть из-за недостаточного проникновения листьев с формальдегидом при низких концентрациях. Убедитесь в том, чтобы обменять свои акции формальдегида часто, как соединение имеет тенденцию к полимеризации с течением времени. Формальдегид решения устойчивы только в течение примерно одного месяца, и этот период вряд ли продлен метанола стабилизации. Рекомендуется для тестирования различных концентраций формальдегида при настройке условий эксперимента.
Количество растительного материала и шлифования:
Важно, чтобы проникнуть небольшое количество листьев материал в большом объеме буфера, чтобы избежать прилипания листьев друг к другу. Листья торчащие часто приводит к недостаточной инфильтрации формальдегида. Кроме того, слишком много растительного материала будет блокировать поры miracloth ткани. Шлифовальные эффективность существенно зависит от использования ступку и пестик, с их идеальной подгонки. Мы регулярно растереть с охлаждаемой жидким азотом пестик и ступка, в отсутствие дополнительных жидким азотом три раза в течение 50 секунд, пока материал измельчается в мелкий порошок.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась немецкий научный фонд (DFG) и совершенство Инициатива немецких федеральных и государственных органов власти.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Protein-A-Agarose | Roche | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
| Protein-G-Agarose | Roche | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
| Anti-hyperacetyl-H4 | Millipore | 06-946 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K5 | Millipore | 07-327 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K8 | Millipore | 07-328 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K12 | Millipore | 07-595 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K16 | Millipore | 07-329 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K18 | Millipore | 07-354 | we used 1μL |
| Anti-acetyl-H3K9 | Millipore | 07-352 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H3K14 | Millipore | 07-353 | we used 1μL |
| Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
| Anti-dimethyl-H3K4 | Millipore | 07-030 | we used 5μL |
| Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche | 11836145001 |
References
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
- Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
- Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
- Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
- Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
- Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
- Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
- Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
- Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
- Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
- Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
- Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).
