זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

1. Crosslinking של חומר צמחי קציר 1-2G עלים ארבידופסיס (6 לקוטר שושנת 10 ס"מ) בתוך שפופרת 50 מ"ל פלסטיק למלא עד 40mL עם חיץ crosslinking. ודא עלים להישאר שקוע, למשל על ידי מלית זכות המותאמים ספוג לסנן מעל פני השטח חיץ. אז במקום צינורות ייבוש. אבק לחדור עבור 10min. כדי להוסיף צינור כל 2.5mL של גליצין 2M להפסיק crosslinking, וכן להפוך צינורות כדי להצדיק פיזור שווה של גליצין. אבק לחדור עבור 5min נוסף וזורקים נוזל תוך קצירת העלים על מסננת. שטפו פעמיים עם העלים 1 ליטר של מים בכוס זכוכית, אז העלים היבשים ביסודיות בעזרת מגבות נייר. איסוף העלים בצינור פלסטיק טריים להקפיא בחנקן נוזלי. חנות יוצאת בשעה -80 ° C עד הבידוד הכרומטין. 2. בידוד של הכרומטין עלים היו הקרקע עם מרגמה פיסטיל כי הוחזקו חנקן נוזלי עד לשימוש. העברת אבקת שפופרת 50 מ"ל פלסטיק להשעות במאגר מיצוי 30 מ"ל # 1. דגירה עבור 15min ב 4 ° C על שייקר תקורה. תסנין ההשעיה דרך ארבע שכבות של miracloth לתוך צינור 50 מ"ל טרי פלסטיק. ספין עבור 20min XG ב 2800 ב 4 ° C. הסר supernatant ו להשעות גלולה עם מברשת צבע במאגר מיצוי 1mL # 2. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 2, אז להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את שאר חיץ. העברת ההשעיה לצינור microfuge ספין 1.5mL עבור 10min ב XG 12,000 ב 4 ° C. בינתיים, להכין 2ml-microfuge צינורות המכיל מאגר מיצוי 1.5mL # 3. הסר supernatant מהצינור סובב (שלב 2.7) ו להשעות גלולה ב 300μL של חיץ מיצוי # 3. ראשית להוסיף נפח קטן של חיץ # 3, להשעות גלולה עם מברשת צבע, ולאחר מכן להוסיף את המאגר הנותרים. בזהירות pipet מושעה גלולה (שלב 2.9) על גבי החיץ 1.5 מ"ל מיצוי # 3 מוכן בשלב 2.8. ודא כי שני השלבים לא לערבב. ספין עבור 1h ב XG 16,000 ב 4 ° C. הסר supernatant ו להשעות הכרומטין גלולה עם מברשת צבע 300μL של חיץ sonication. Sonicate הכרומטין עם sonotrode, או באמבטיה קולי, לגודל ה-DNA של 400bp כ. כאשר sonicating, לעשות הכרומטין בטוח לא יהיה מחומם מעל כ -30 ° C כדי להגן רגישים לחום crosslinks. משך sonication צריך להיקבע באופן ניסיוני, כי זה משתנה באופן משמעותי בין התקנים sonication שונים. לקבלת הדרכה, ההגדרות עבור שני מכשירים שונים ניתנים: עבור sonication עם sonotrode המותג Bandelin לחשוף הכרומטין בצינור microfuge 0.6mL חמש פעמים עד 20 התפרצויות עם הגדרות 25%, מחזור כוח = 50. תוך כדי כך, מדגם מגניב אחרי כל 20 התפרצויות ה באמבט קרח. עבור sonication עם אמבטיה Diagenode Bioruptor קולי, למלא אמבטיה עם מים וקרח sonicate עשר פעמים במשך 30 שניות בתוך צינורות microfuge 1.5mL עם ההגדרה "גבוה". אחרי כל 30 שניות, דגימות מגניב עוד 30 שניות. ספין sonicated מדגם עבור 5min ב g 16,000 ב 4 ° C כדי לזרז חומר שלא נמס. Supernatant יכול ישירות לשמש immunoprecipitation. לחלופין, ניתן דגימות הלם קפוא בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. 3. Immunoprecipitation הכן 2-mL צינורות microfuge המכיל חלבון 40μL agarose ו 1.8mL של חיץ נוגדן מחייב. הוסף 200μL של הכנת הכרומטין (שלב 2.13). דגירה צינורות עבור 1h על שייקר תקורה. בטל חלבון חרוזים agarose ולהשתמש supernatant עבור immunoprecipitation. הסרת 40μL-aliquot כדי לקבוע ריכוז הכרומטין ("קלט"). הוסף 30μL חלבון agarose ואת כמות הנוגדנים שינוי ספציפי זה המצוין בטבלה שלהלן של ריאגנטים ספציפיים וציוד ההשעיה 400μL הכרומטין sonicated. דגירה עבור 2.5h או לילה על שייקר תקורה ב 4 ° C. ספין למטה חרוזים עבור 2min ב 440 x ז לשטוף עם חרוז גלולה 900μL של חיץ כל לשטוף (ראה רשימה להלן). במשך כל חיץ, חרוזים דגירה במאגר עבור 10min על שייקר ממעל על 4 מעלות צלזיוס, אז בשביל ספין 2min ב XG 440, להשליך supernatant, ולהוסיף את המאגר הבא. מלח נמוכה לשטוף חיץ מלח גבוהה לשטוף חיץ LiCl לשטוף חיץ TE לשטוף חיץ לאחר לשטוף הסופי, להסיר לחלוטין כל חיץ הנותרים. 4. De-crosslinking של היסטונים ו-DNA, וטיהור של ה-DNA זירז הוסף 100μL של חיץ דה crosslinking של גלולה agarose מדגם "קלט" את 40μl משלב 3.4, תערובת של 5min על מערבל מערבולת, דגימות ספין, incuבייט ב 65 ° C במשך הלילה. לטהר DNA עם DNA מסחרי או ערכת טיהור PCR. בדרך כלל 5μl של דילול של 1:05 eluate הטור הסופי מספיקים כדי לבצע קונבנציונאלי מוקד ספציפי בזמן אמת כמותי RT-PCR (RT-qPCR). 5. טבלה של מאגרים Crosslinking חיץ סודיום בוטיראט 10mm סוכרוז 400mm טריס-HCl, pH 8.0 10mm β-Mercaptoethanol 5mm פורמלדהיד 3% (V / V) הפקת המאגר # 1 סודיום בוטיראט 10mm סוכרוז 400mm טריס-HCl, pH 8.0 10mm β-Mercaptoethanol 5mm מעכבי פרוטאז השלם 1x הפקת המאגר # 2 סודיום בוטיראט 10mm סוכרוז 250mm טריס-HCl, pH 8.0 10mm β-Mercaptoethanol 5mm MgCl 2 10mm טריטון X-100 1% (w / v) מעכבי פרוטאז השלם 1x הפקת המאגר # 3 סודיום בוטיראט 10mm סוכרוז 1.7M טריס-HCl, pH 8.0 10mm β-Mercaptoethanol 5mm MgCl 2 2mm טריטון X-100 0.15% (w / v) מעכבי פרוטאז השלם 1x Sonication חיץ טריס-HCl, pH 8.0 25mm EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 5mm SDS 0.5% (w / v) מעכבי פרוטאז השלם 1x נוגדן מחייב חיץ טריס-HCl, pH 8.0 50mm EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 1mm NaCl 150mm טריטון X-100 0.1% (w / v) מלח נמוכה לשטוף חיץ NaCl 150mm SDS 0.1% (w / v) טריטון X-100 1% (w / v) EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 2mm טריס-HCl, pH 8.0 20mm מלח גבוהה לשטוף חיץ NaCl 500mm SDS 0.1% (w / v) טריטון X-100 1% (w / v) EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 2mm טריס-HCl, pH 8.0 20mm LiCl לשטוף חיץ ליתיום כלוריד 250mm Nonidet-P40 1% (V / V) נתרן desoxycholate 1% (w / v) EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 1mm טריס-HCl, pH 8.0 20mm TE לשטוף חיץ EDTA-NaOH, ה-pH 8.0 10mm טריס-HCl, pH 8.0 1mm Decrosslinking חיץ טריס-HCl, pH 6.8 62.5mM NaCl 200mm SDS 2% (w / v) DTT 10mm 6. נציג התוצאות: הביטוי של הגן ארבידופסיס thaliana PR2 הגנה קידוד β-1,3-glucanase עם פעילות מיקרוביאלית 12, הנגרמת על ידי benzothiadiazole (BTH), אנלוגי סינתטי של חומצה סליצילית הורמון צמח 3. איור 1 מראה כי הפעלת הביטוי PR2 קשורה לעלייה acetylation של שאריות ליזין על היסטון H3 ו-H4 על האמרגן PR2. מאז צפיפות הנוקלאוזום פוחתת במהלך הפעלת הגנים 13, ערכים acetylation היסטון היו מנורמל עבור האות המתקבל עם נוגדן לאזור משתנה של היסטון 3. איור 1 BTH גורם acetylation היסטון על האמרגן PR2 ב ארבידופסיס. צמחים שטופלו 100μM BTH או פקד אבקת wettable. לאחר 72h, העלים נאספו הכרומטין היה מבודד. האות המתקבל לאחר משקעים עם נוגדנים ספציפיים acetylation (כמצוין באיור) היה מנורמל לאות מתקבל על ידי משקעים עם נוגדן ל תחום משתנה של היסטון H3. הכרומטין זירז היה לכמת על ידי RT-qPCR. הנתונים סטנדרטי עבור רמות שינוי היסטון בהעדר טיפול BTH.