Détection des modifications des histones dans les feuilles des plantes

1. La réticulation de la matière végétale Récolte 1-2g de feuilles d'Arabidopsis (6 à 10cm de diamètre rosette) dans un tube en plastique de 50 ml et compléter à 40 mL avec le tampon de réticulation. Assurez-vous que les feuilles restent immergés, par exemple en farce d'un droit adapté filtre éponge dessus de la surface du tampon. Ensuite, placez les tubes dans un dessiccateur. Vide infiltrer pour 10min. Pour chaque tube 2,5 ml de glycine 2M pour arrêter de réticulation, et inverser les tubes pour justifier la dispersion égale de la glycine. Vide d'infiltrer pour une autre 5min et jeter fluide pendant la récolte des feuilles sur un tamis. Laver les feuilles à deux reprises avec 1 litre d'eau dans un récipient en verre, puis le laisse sécher avec des serviettes en papier. Ramasser les feuilles dans un tube en plastique douce et geler dans l'azote liquide. Magasin de feuilles à -80 ° C jusqu'à ce que l'isolement chromatine. 2. Isolement de la chromatine Feuilles ont été broyées avec du mortier et pistil qui ont été conservés dans l'azote liquide jusqu'à leur utilisation. Transfert de poudre pour un tube en plastique de 50 ml et de suspendre dans 30mL de tampon d'extraction n ° 1. Incuber pendant 15min à 4 ° C sur un agitateur vertical. Filtrat à travers la suspension de quatre couches de miracloth dans un tube en plastique de 50 ml fraîche. Spin pour 20min à 2800 xg à 4 ° C. Retirer le surnageant et suspendre culot avec un pinceau dans le tampon d'extraction 1ml # 2. Ajouter d'abord un petit volume de tampon n ° 2, puis de suspendre culot avec un pinceau, puis ajoutez le reste de la mémoire tampon. Transfert de suspension pour un tube de micro et de 1,5 ml de spin pour 10min à 12.000 xg à 4 ° C. Pendant ce temps, préparez-2mL microcentrifugeuse tubes contenant 1,5 ml de tampon d'extraction n ° 3. Retirer le surnageant du tube filé (étape 2.7) et de suspendre le culot dans 300μL de tampon d'extraction n ° 3. Ajouter d'abord un petit volume de tampon n ° 3, suspendre culot avec un pinceau, puis ajoutez le tampon restant. Soigneusement pipette le culot en suspension (étape 2.9) sur le dessus de la mémoire tampon de 1,5 ml d'extraction n ° 3 préparé à l'étape 2.8. Assurez-vous que les deux phases se mélangent pas. Spin pour 1h à 16 000 xg à 4 ° C. Retirer le surnageant et suspendre la chromatine culot avec un pinceau dans 300μL de tampon de sonication. Soniquer chromatine avec une sonotrode, ou dans un bain à ultrasons, à une taille d'ADN d'environ 400bp. Lorsque sonication, assurez-vous que la chromatine ne sera pas chauffé au-dessus d'environ 30 ° C pour protéger sensibles à la chaleur réticule. La durée de la sonication doit être déterminée expérimentalement, car il varie significativement entre les appareils sonication différents. Pour obtenir des conseils, des paramètres pour deux appareils différents sont prévus: Pour sonication avec une marque de Bandelin sonotrode chromatine exposer dans le tube 0.6ml microcentrifugeuse cinq fois à 20 coups avec les paramètres de 25% de puissance, cycle = 50. Ce faisant, l'échantillon fraîche après chaque 20 ème éclate dans un bain de glace. Pour sonication avec un bain à ultrasons Bioruptor Diagenode, remplissez salle de bain avec eau et la glace et soniquer dix fois pendant 30 secondes en microtubes de 1,5 ml avec réglage «élevé». Après toutes les 30 secondes, les échantillons au frais pendant 30 secondes. Spin soniqué échantillon pour 5min à 16.000 g à 4 ° C pour précipiter matière non dissoute. Le surnageant peut être directement utilisé pour l'immunoprécipitation. Alternativement, les échantillons peuvent être un choc congelés dans l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. 3. Immunoprécipitation Préparer microtubes de 2 ml contenant la protéine A 40μL. Agarose et 1,8 ml d'anticorps contraignant tampon Ajouter 200 ul de la préparation de chromatine (étape 2.13). Incuber les tubes pour 1h sur un agitateur vertical. Jeter la protéine A billes d'agarose et l'utilisation surnageant pour immunoprécipitation. Supprimer une partie aliquote 40μL-pour déterminer la concentration de chromatine ('input'). Ajouter 30μL protéines-A. Agarose et le montant de la modification d'anticorps spécifique qui est indiqué dans le tableau ci-dessous des réactifs et équipements spécifiques à la suspension chromatine soniquée 400μL Incuber pendant 2.5h ou toute la nuit sur un agitateur vertical à 4 ° C. Isoler perles pour 2min à 440 x g. Lavez perles culot avec 900μL de chaque tampon de lavage (voir la liste ci-dessous). Pour chaque tampon, perles incubation dans le tampon pendant 10 minutes sur un agitateur vertical à 4 ° C, puis de spin pour 2min à 440 xg, éliminer le surnageant et ajouter le tampon suivant. Faible tampon de lavage du sel Haute tampon de lavage du sel LiCl tampon de lavage TE tampon de lavage Après le lavage final, enlever complètement toute tampon restant. 4. De-réticulation des histones et l'ADN, et la purification de l'ADN précipité Ajouter 100 pi de tampon de-réticulation au culot d'agarose et de l'échantillon «d'entrée» du 40μl de l'étape 3.4, mélanger pendant 5min sur un vortex, les échantillons de spin, et incubateursBate à 65 ° C pendant la nuit. Purifier l'ADN avec un ADN commercial ou kit de purification de PCR. Typiquement 5uL de la dilution 1:05 de l'éluat de la colonne finale sont suffisants pour effectuer conventionnelles spécifiques de locus en temps réel RT-PCR quantitative (RT-qPCR). 5. Table des tampons Mémoire tampon de réticulation Butyrate de sodium 10mM Saccharose 400mm Tris-HCl, pH 8,0 10mM β-mercaptoéthanol 5mM Formaldéhyde 3% (v / v) Tampon d'extraction n ° 1 Butyrate de sodium 10mM Saccharose 400mm Tris-HCl, pH 8,0 10mM β-mercaptoéthanol 5mM Inhibiteur de protéase complète 1x Tampon d'extraction n ° 2 Butyrate de sodium 10mM Saccharose 250mm Tris-HCl, pH 8,0 10mM β-mercaptoéthanol 5mM MgCl 2 10mM Triton X-100 1% (p / v) Inhibiteur de protéase complète 1x Tampon d'extraction n ° 3 Butyrate de sodium 10mM Saccharose 1,7 M Tris-HCl, pH 8,0 10mM β-mercaptoéthanol 5mM MgCl 2 2mM Triton X-100 0,15% (p / v) Inhibiteur de protéase complète 1x Tampon de sonication Tris-HCl, pH 8,0 25mM EDTA-NaOH, pH 8,0 5mM SDS 0,5% (p / v) Inhibiteur de protéase complète 1x Buffer fixation des anticorps Tris-HCl, pH 8,0 50mM EDTA-NaOH, pH 8,0 1mM NaCl 150 mM Triton X-100 0,1% (p / v) Faible tampon de lavage du sel NaCl 150 mM SDS 0,1% (p / v) Triton X-100 1% (p / v) EDTA-NaOH, pH 8,0 2mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM Haute tampon de lavage du sel NaCl 500mm SDS 0,1% (p / v) Triton X-100 1% (p / v) EDTA-NaOH, pH 8,0 2mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM LiCl tampon de lavage Le chlorure de lithium 250mm Nonidet-P40 1% (v / v) Désoxycholate de sodium 1% (p / v) EDTA-NaOH, pH 8,0 1mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM TE tampon de lavage EDTA-NaOH, pH 8,0 10mM Tris-HCl, pH 8,0 1mM Buffer Decrosslinking Tris-HCl, pH 6,8 62.5mm NaCl 200 mM SDS 2% (p / v) TNT 10mM 6. Les résultats représentatifs: L'expression du gène de la défense d'Arabidopsis thaliana codant pour une β PR2-1,3-glucanase ayant une activité antimicrobienne 12, a été induite par benzothiadiazole (BTH), un analogue synthétique de l'acide salicylique, hormone végétale 3. La figure 1 montre que l'activation du PR2 expression est associée à une augmentation de l'acétylation des résidus lysine des histones H3 et H4 sur le promoteur PR2. Comme la densité diminue au cours de 13 nucléosome activation des gènes, les valeurs ont été normalisées acétylation des histones pour le signal obtenu avec un anticorps à une région invariante de 3 histones. Figure 1 BTH induit l'acétylation des histones sur le promoteur PR2 chez Arabidopsis. Les plantes ont été traitées avec 100 microns BTH ou un contrôle de poudre mouillable. Après 72h, les feuilles ont été recueillies et de la chromatine a été isolé. Le signal obtenu après précipitation avec l'acétylation des anticorps spécifiques (comme indiqué dans la figure) a été normalisé au signal obtenu par précipitation avec un anticorps à un domaine invariant de l'histone H3. Chromatine précipité a été quantifiée par RT-qPCR. Les données sont normalisées pour les niveaux modification des histones, en l'absence de traitement BTH.