检测组蛋白修饰在植物叶片

1。植物材料的交联收获1 – 2G的拟南芥叶（6到10cm莲座直径）在50毫升的塑料管，填补了交联的缓冲区，以40ML。 确保叶留沉浸例如，通过量身定制的过滤海绵权馅上述缓冲表面。然后放置在干燥器管。 真空渗透为10分钟。每管加入2.5毫升2M甘氨酸停止交联，并反转管，以保证平等的甘氨酸分散。 真空渗透另一个5分钟，并丢弃液体，同时收获叶筛子。 洗叶两次1L水在玻璃烧杯中，然后用纸巾彻底干叶。 收集在一个新的塑料管的叶子和液氮冻结。商店叶在-80 ° C直到染色质隔离。 2。染色质隔离叶地面砂浆和雌蕊，在液氮中保存，直到使用。 转让粉，50毫升的塑料管，并暂停在30ml提取缓冲液＃1。 在4 ° C孵育15分钟上的开销摇床。 滤液暂停通过四层的miracloth到一个新的50毫升的塑料管。 在2800 XG 20分钟旋转4 ° C。 去除上清液，并中止与油漆刷在1​​ML提取缓冲液＃2沉淀。首先添加一个缓冲区＃2，体积小，然后用画笔暂停颗粒，然后添加其余的缓冲区。 转移悬浮在12000 XG到1.5ml离心管和旋转为10分钟，4 ° C。 同时，准备液2ml离心管1.5ml的提取缓冲液＃3。 从纺管（步骤2.7）去除上清液，并暂停在提取缓冲液＃3300μL沉淀。首先添加一个缓冲区＃3，体积小，暂停与画笔颗粒，然后添加剩余的缓冲区。 仔细吸管的悬浮颗粒（步骤2.9）1.5 mL提取缓冲液中，在步骤2.8准备＃3顶部。确保两个阶段不会混合。上半年的16,000 XG旋转4 ° C。 去除上清液，并中止与染色质颗粒在超声缓冲液300μL的油漆刷。 超声sonotrode，或在超声波浴染色，一个约400bp的DNA大小。当超声，确保染色不会被加热以上约30 ° C保护热敏感的交联。需要通过实验确定，因为它变化显著不同超声设备的超声时间。为指导，提供两个不同的设备设置： 对于超声一个Bandelin品牌sonotrode暴露在0.6mL离心管中染色质的5倍至20连发设置25％的电力，周期= 50。虽然这样做，在冰浴后，每20 次阵阵清凉样品。 超声与Diagenode Bioruptor超声波浴，填补水和冰的浴缸和超声设置“高”的30秒在1.5ml的离心管的10倍。每隔30秒后，再过30秒冷却样品。 旋转超声16,000克的样品为5min，4 ° C至沉淀不溶物质。上清可直接用于免疫。另外，样品可在液氮中冷冻，并保存于-80℃直至进一步的冲击。 3。免疫沉淀准备2 ml离心管40μL蛋白 – 琼脂糖和抗体结合缓冲液1.8mL。染色准备加入200μL（步长2.13）。 开销摇床孵育1h后管。 放弃蛋白A琼脂糖珠和使用免疫上清。 删除一个40μL等分，以确定染色质浓度（“输入”）。 加入30μL蛋白一琼脂糖和修改特异性抗体，是在特定的试剂和仪器400μL超声染色质悬浮如下表所示金额。 2.5H或架空摇床过夜孵育4 ° C。 自旋为2分钟，在440 × G.珠洗珠颗粒，每个洗涤缓冲液900μL（见以下列表）。对于每一个缓冲区，然后在10分钟的缓冲开销摇床4℃，孵化珠为2分钟旋转440 XG，弃上清液，并添加下一个缓冲区。 低盐缓冲液洗高盐缓冲液洗氯化锂洗涤缓冲液 TE缓冲液洗最后一次洗涤后，彻底清除任何剩余的缓冲区。 4。组蛋白和DNA的交联和沉淀DNA纯化将去交联缓冲区100μL琼脂糖颗粒和步骤3.4样品40μl的“输入”，在旋涡混合器混合5min后，旋转样品，并培育贝特在65 ° C过夜。 商业的DNA或PCR纯化试剂盒纯化的DNA。 通常情况下1:5稀释的最后一列洗脱液5μL足以执行特定常规轨迹实时定量RT – PCR（RT – qPCR的）。 5。缓冲区表 交联的缓冲区 丁酸钠 10MM 蔗糖 400MM 的Tris – HCl，pH值8.0 10MM β-巯基乙醇 5MM 甲醛 3％（V / V） 提取缓冲液＃1 丁酸钠 10MM 蔗糖 400MM 的Tris – HCl，pH值8.0 10MM β-巯基乙醇 5MM 完整的蛋白酶抑制剂 1X 提取缓冲液＃2 丁酸钠 10MM 蔗糖 250MM 的Tris – HCl，pH值8.0 10MM β-巯基乙醇 5MM MgCl 2的 10MM TRITON X – 100 1％（W / V） 完整的蛋白酶抑制剂 1X 提取缓冲液＃3 丁酸钠 10MM 蔗糖 1.7M 的Tris – HCl，pH值8.0 10MM β-巯基乙醇 5MM MgCl 2的 2MM TRITON X – 100 0.15％（W / V） 完整的蛋白酶抑制剂 1X 超声缓冲 的Tris – HCl，pH值8.0 25MM EDTA – NaOH溶液，pH值8.0 5MM SDS 0.5％（W / V） 完整的蛋白酶抑制剂 1X 抗体结合缓冲液 的Tris – HCl，pH值8.0 50MM EDTA – NaOH溶液，pH值8.0 1MM 氯化钠 150MM TRITON X – 100 0.1％（W / V） 低盐缓冲液洗 氯化钠 150MM SDS 0.1％（W / V） TRITON X – 100 1％（W / V） EDTA – NaOH溶液，pH值8.0 2MM 的Tris – HCl，pH值8.0 20MM 高盐缓冲液洗 氯化钠 500MM SDS 0.1％（W / V） TRITON X – 100 1％（W / V） EDTA – NaOH溶液，pH值8.0 2MM 的Tris – HCl，pH值8.0 20MM 氯化锂洗涤缓冲液氯化锂 250MM Nonidet – P40 1％（V / V） 钠去氧胆 1％（W / V） EDTA – NaOH溶液，pH值8.0 1MM 的Tris – HCl，pH值8.0 20MM TE缓冲液洗 EDTA – NaOH溶液，pH值8.0 10MM 的Tris – HCl，pH值8.0 1MM Decrosslinking缓冲区 的Tris – HCl，pH值6.8 62.5mM 氯化钠 200MM SDS 2％（W ​​/ V） 数码地面电视 10MM 6。代表性的成果： 拟南芥PR2防御基因的表达，编码β -1,3 -葡聚糖酶，抗菌活性 12，苯并噻二唑（BTH）诱导，人工合成的植物激素水杨酸3模拟图1表明，激活 PR2的表达与组蛋白乙酰化赖氨酸残基上增加相关。 H3和H4 PR2的发起人。由于核小体密度降低在基因的激活13，组蛋白乙酰化值正常化不变区域的组蛋白3抗体获得的信号。 图1 BTH诱导PR2的发起人在拟南芥组蛋白乙酰化 。植物均采用100μm的BTH或可湿性粉剂控制。 72h后，叶收集和染色质隔离。乙酰特异性抗体（如图所示）沉淀后得到的信号是标准化，以获得一种抗体降水不变域的组蛋白H3的信号。沉淀染色质，定量RT – qPCR的。数据是在BTH处理的情况下组蛋白修饰水平的标准化。