Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması
Summary
Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize tarif<em> In vitro</em> Tahlil T1D geliştirmek için risk altındaki kişilerde bağışıklık dengesizlik tespit yeteneğine sahip.
Abstract
Düzenleyici T hücreleri (Tregs), self-antijenleri immün tolerans kritik arabulucular. Buna ek olarak, önemli bir enfeksiyon sonrası immün yanıt düzenleyicileri. Tregs benzersiz yüzey işaretleyici tanımlamak için çabalarına rağmen, sadece benzersiz özellik efektör T hücrelerinin çoğalması ve işlevi bastırmak için yeteneğidir. In vitro tayinlerde, sadece insan Treg fonksiyon değerlendirilmesinde kullanılabileceğini açık olmakla birlikte, otoimmün hastalıkları (Tip 1 Diyabet-T1D gibi) ihtiyacı olan kişilerde sağlıklı hücre ve hücreler izole kesitsel çalışmalardan elde edilen sonuçlar değerlendirilirken, bu sorunlu olur karşılaştırılabilir. Cevapçı oranları ve insan, antijen sunan hücrelerin sayısı ve türü (APC), in vitro bastırma tayinlerde: Cevapçı T hücreleri, stimülasyon doğası ve gücü, Treg sayısı ve türü laboratuvarlar arasında büyük bir değişkenlik yoktur. Bu değişkenliği Treg fonksiyonu zor ölçüm çalışmalar arasında karşılaştırma yapar. Treg alan sağlıklı kişilerde ve otoimmün hastalıklar ile çalışacak bir standart bastırma tahlil gerekiyor. Biz, pankreas β-hücrelerinin otoimmün yıkımı temel konularla karşılaştırıldığında sağlıklı gönüllüler izole edilen T hücrelerinin uyarılması çok az test içi değişkenlik gösterir in vitro bastırma tayininde geliştirdik . Bu parça ana hedefi, farklı konu grupları arasında karşılaştırma sağlayan in vitro insan bastırma tayininde bir tanımlamak için. Ayrıca, bu testte, küçük bir fonksiyon nTreg kaybı tasvir ve gelecekte daha da kaybı, önleyici immünomodülatör tedavi 1 yararlanabilir böylece tespit konularda tahmin etmek potansiyele sahiptir. Aşağıda, bu yordamı yer alan adımları ayrıntılı bir açıklama sağlar. Treg fonksiyonu ölçmek için kullanılan in vitro bastırma tayininde standardizasyon katkıda bulunmayı umuyoruz. Buna ek olarak, bağışıklık dengesizliği erken bir devlet ve T1D için potansiyel bir fonksiyonel biyomarker tanımak için bir araç olarak bu testte sunuyoruz.
Protocol
Discussion
Tregs tek benzersiz özellik olarak, baskılayıcı fonksiyonu aynı içinde ve farklı çalışmalar arasında hastalık gelişiminin farklı aşamalarını güvenilir ve düzgün konular arasında test edilmelidir. Biz bu testinin standardizasyonu için katkı olarak laboratuvarda geliştirilen bastırma tahlil detayları sunar. Geniş optimizasyon çalışması, insan anti-CD3 kaplı boncuklar (APC olarak hücre ile birlikte 1μg/ml konsantrasyonu UCHT1 klon (piyasada mevcut 5μg/ml karşı) ile T hücre stimülasyon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Wisconsin ve Çocuk Araştırma Enstitüsü Wisconsin Juvenil Diabetesat Medical College Max McGee, Ulusal Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, ya da yazının hazırlanmasında rol oynamıştır.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Homemade | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Homemade | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Homemade | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Homemade | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. i. o. r. e. s. p. o. n. s. i. v. e. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, . An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
