Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса
Summary
Tregs являются мощными супрессоры иммунной системы. Существует недостаток уникальных маркеров поверхности, чтобы определить их, следовательно, определения Tregs в первую очередь функциональны. Здесь мы опишем оптимизированы<em> В пробирке</em> Анализ позволяет идентифицировать иммунный дисбаланс в предметы на риск развития СД1.
Abstract
Регуляторных Т-клеток (Tregs) являются важнейшими медиаторами иммунной толерантности к самостоятельной антигенов. Кроме того, они играют решающую роль регуляторов иммунного ответа следующие инфекции. Несмотря на усилия по выявлению уникальных маркеров на поверхности Tregs, только уникальная особенность заключается в их способности подавлять пролиферацию и функцию эффекторных Т-клеток. Хотя очевидно, что только в лабораторных анализов могут быть использованы в оценке человеческой функции Treg, это становится проблематичным при оценке результатов из перекрестных исследований, в которых здоровые клетки и клетки, выделенные из пациентов с аутоиммунными заболеваниями (например, диабетом типа 1-СД1) нуждаются в для сравнения. Существует большая вариабельность лабораторий в количестве и типе ответчик Т-клеток, характера и силы раздражения, Treg: ответчик соотношения и количества и типа антиген-представляющих клеток (АПК), используемых в человека в пробирке тесты подавления. Эта изменчивость делает сравнение между исследованиями измерения Treg функции трудно. Treg поле должно стандартизированного анализа подавления, что будет хорошо работать с обоими здоровых людей и людей с аутоиммунными заболеваниями. Мы разработали в пробирке подавления анализ показывает, что очень мало внутри-анализ изменчивости стимуляции Т-клеток, выделенных из здоровых добровольцев по сравнению с людьми с сопутствующими аутоиммунными разрушение поджелудочной β-клеток. Основной целью этой части является описание в пробирке человеческих анализа подавления, что позволяет провести сравнение между различными группами тему. Кроме того, этот анализ имеет потенциал, чтобы очертить небольшой потерей в nTreg функции и предвидеть дальнейшую потерю в будущем, таким образом, определение субъектов, которые могут извлечь пользу из профилактическую терапию иммуномодулирующими 1. Ниже мы приводим подробное описание этапов этой процедуры. Мы надеемся внести свой вклад в стандартизацию в пробирке подавления анализа, используемые для измерения Treg функции. Кроме того, мы предлагаем этот анализ в качестве инструмента для признать ранней стадии иммунного дисбаланса и потенциал функциональных биомаркером СД1.
Protocol
Discussion
Как только уникальная особенность, чтобы Tregs, подавляющие функции должны быть проверены надежно и равномерно между субъектами на различных стадиях развития заболевания в пределах одного и между различными исследованиями. Мы предлагаем детали подавления анализ в нашей лаборатории, ка…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Макс Макги Национального исследовательского центра по делам несовершеннолетних Diabetesat Медицинского колледжа Висконсина и детской научно-исследовательского института штата Висконсин. Спонсоры не участвовал в дизайн исследования, сбор и анализ данных, или подготовке рукописи.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Homemade | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Homemade | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Homemade | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Homemade | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. i. o. r. e. s. p. o. n. s. i. v. e. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, . An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
