Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance
Summary
Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde<em> In vitro</em> Assay kunnen identificeren immuun onbalans bij patiënten in gevaar te ontwikkelen T1D.
Abstract
Regulerende T-cellen (Tregs) zijn kritisch bemiddelaars van immuun tolerantie voor zelf-antigenen. Daarnaast zijn ze van cruciaal belang zijn regulatoren van de immuunrespons na een infectie. Ondanks inspanningen om unieke oppervlakte marker op Tregs te identificeren, het enige unieke eigenschap is hun vermogen om de proliferatie en de functie van effector T-cellen te onderdrukken. Hoewel het duidelijk is dat alleen in-vitro-testen kunnen worden gebruikt bij de beoordeling van de menselijke Treg functie, wordt dit probleem bij de beoordeling van de resultaten van cross-sectionele studies waarbij gezonde cellen en cellen geïsoleerd uit patiënten met auto-immuunziekten (zoals type 1 diabetes-T1D) nodig te vergelijken. Er is een grote variabiliteit tussen laboratoria in het aantal en type van de reagerende T-cellen, de aard en de sterkte van de stimulatie, Treg: responder ratio's en het aantal en type van antigeen-presenterende cellen (APC) gebruikt in de menselijke in vitro onderdrukking assays. Deze variabiliteit maakt een vergelijking tussen de studies meten van Treg functie moeilijk. De Treg veld heeft behoefte aan een gestandaardiseerde test onderdrukking die goed werkt met zowel bij gezonde vrijwilligers en mensen met auto-immuunziekten. Hebben we een in vitro assay onderdrukking dat er zeer weinig intra-assay variabiliteit in de stimulatie van T-cellen geïsoleerd uit gezonde vrijwilligers in vergelijking met proefpersonen met een onderliggende auto-immune vernietiging van de pancreas β-cellen shows. Het belangrijkste doel van dit stuk is om een te beschrijven in vitro humane onderdrukking test die vergelijking tussen de verschillende groepen onder voorbehoud maakt. Bovendien, deze test heeft de potentie om een klein verlies in nTreg functie af te bakenen en te anticiperen op verder verlies in de toekomst, waardoor het identificeren van patiënten die baat kunnen hebben bij preventieve immunomodulerende therapie 1. Hieronder geven we een grondige beschrijving van de stappen in deze procedure. We hopen een bijdrage te leveren aan de standaardisatie van de in vitro onderdrukking-test gebruikt om de Treg functie te meten. Daarnaast bieden wij u deze test als een hulpmiddel om een vroege staat van het immuunsysteem onbalans en een mogelijke functionele biomarker voor T1D herkennen.
Protocol
Discussion
Als enige unieke eigenschap om Tregs, moet onderdrukkende betrouwbaar functioneren en op uniforme wijze worden getest tussen de onderwerpen op verschillende fasen van de ziekte ontwikkeling binnen het zelfde en tussen de verschillende studies. Wij bieden u de details van de onderdrukking test ontwikkeld in ons laboratorium als onze bijdrage aan de standaardisatie van deze test. In onze uitgebreide optimalisatie studie hebben we vastgesteld dat T-cel stimulatie met anti-humaan CD3-gecoate kralen (UCHT1 kloon, de concentr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetesat Medical College of Wisconsin en Children's Research Institute of Wisconsin. De financiers hadden geen rol in de opzet van de studie, gegevensverzameling en-analyse, of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham Pharmacia Biotech | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | Gibco | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Pharmingen | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Pharmingen | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Pharmingen | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Pharmingen | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Pharmingen | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Pharmingen | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Homemade | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Homemade | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Homemade | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Homemade | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | Perkin Elmer | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | Perkin Elmer | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. i. o. r. e. s. p. o. n. s. i. v. e. Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, . An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
