マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

コンパートメントのためのE18胎児ラット皮質ニューロンの準備出開始する前に、それは37℃に必要なすべての培地および試薬を温めることが重要です。 70％エタノールでダウン拭いて、ボンネットに配置されている細胞（例えば、ゴムの球根、チューブラック、メディアのボトルなど）、およびその調製のために使用されるすべてのものを殺菌することも重要です。 1ミリリットルの氷冷カルシウムフリーマグネシウムフリー解剖のバッファを含む15 mlのチューブに場所E18胎児ラット皮質の2つ（一つの脳、以前に解剖して）。 2mlと0.125％、最終的なトリプシン濃度に最終的なボリュームをもたらし、解剖バッファ内の皮質に0.25％トリプシン- EDTA 1 mlの。 8分間37℃の水浴中に15 mlのチューブを置きます。 この時間の間に、火災研磨3ガラスパスツールピペットは、無菌性を維持するために生物学的安全キャビネット内で、連続して小さな開口部を形成する。 皮質の8分間のインキュベーションの後、DMEM 10 mlのトリプシンの反応を阻止するために皮質に10％FBSを含む追加。 2分間2500rpmで皮質とDMEM/10％FBSを含む15 mlチューブを遠心します。 バイオセーフティキャビネットでは、接続された真空吸引によるガラスパスツールピペットを用いて皮質から上清を取り除く。妨害またはペレットが剥がれないよう注意してください。 皮質ペレットと静かにピペット上下にNMBの1 mlの。それは空気の気泡が酸化によって細胞を損傷することができるように、上下にペッティングしながら、気泡を作らないように非常に重要です。 気泡を導入しないように注意して、再度、5回を最後に滅菌ゴム球を取り付け、最大ペッティングやダウンによって皮質をひいて粉にするために広い開口部とファイアーポリッシュパスツールピペットを使用してください。減少した開口部のサイズと、それぞれ、他の2つのガラスピペットでこのプロセスを続けます。 粉砕した後、2分間、2500rpmで再び細胞を遠心分離。 遠心分離後、再び上清を除去し、NBMの2mlに細胞ペレットを再懸濁します。 45 UMセルストレイナーを通して再懸濁した細胞溶液をフィルタ。 、トリパンブルーで細胞を染色カウント、およびデバイスにロードされます。我々は通常、デバイスごとに細胞の20 ulを読み込みます。 注 ：細胞の最終濃度が250万細胞/ mlと800万細胞/ mlの間に典型的である細胞のロード細胞がカウントされた後、それはデバイス内のセルをロードする時間です。 無菌性を維持するために生物学的安全キャビネットにNBMを含む事前に準備したデバイスをもたらす。 真空吸引により井戸から余分なメディアを取り出します。しかし、メディアのすべてを削除しないように注意してください – メインチ​​ャネル内の一部のメディアが存在している必要があります。 デバイスの上部左側のリザーバー（必要に応じて図を参照）への細胞の20 ulを適用します。細胞はデバイスに流れ込むとPLL処理面に付着する。 ロード後に、細胞がアタッチできるように10分間インキュベーターに戻し、細胞を含むデバイスに置く。 10分後、戻ってインキュベーター内のメディアと場所のデバイスとの貯水池を埋める。