Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

La capacità di manipolare l'espressione genica è la pietra angolare della moderna embriologia giorno sperimentale, che porta alla spiegazione di molteplici vie di sviluppo. Diverse tecnologie potenti e ben consolidata transgenici sono a disposizione per manipolare i livelli di espressione genica nel topo, consentendo la generazione di entrambi perdita e guadagno di funzione dei modelli. Tuttavia, la generazione di topo transgenici è sia costoso e richiede tempo. Metodi alternativi di manipolazione genetica sono stati quindi ampiamente ricercato. In utero elettroporazione è un metodo di consegna del gene in embrioni di topo ^1,2 vivere che abbiamo adattato con successo ^3,4. È in gran parte sulla base del successo nel campo delle tecnologie di elettroporazione ovo che sono comunemente utilizzati in pulcino ^5. In breve, il DNA è iniettato nei ventricoli aperto di sviluppo del cervello e l'applicazione di una corrente elettrica provoca la formazione di pori transienti nelle membrane cellulari, permettendo l'assorbimento del DNA nelle cellule. Nelle nostre mani, gli embrioni possono essere efficacemente elettroporate fin dal giorno embrionale (E) 11,5, mentre l'orientamento dei giovani embrioni richiederebbe un eco-guidata protocollo microiniezione, come descritto in precedenza ^6. Al contrario, E15.5 è l'ultima tappa si può facilmente electroporate, a causa della insorgenza di differenziazione dell'osso parietale e frontale, che ostacola microiniezione nel cervello. Al contrario, la retina è accessibile fino alla fine di embriogenesi. Gli embrioni possono essere raccolti in un punto qualsiasi momento durante il periodo embrionale o postnatale precoce. L'iniezione di un costrutto giornalista facilita l'identificazione delle cellule transfettate.

Ad oggi, l'elettroporazione in utero è stata più utilizzata per l'analisi dello sviluppo neocorticale ^1,2,3,4. Studi più recenti hanno preso di mira la retina embrionale ^7,8,9 e ^10,11,12 talamo. Qui vi presentiamo una versione modificata del protocollo di elettroporazione in utero, che può essere facilmente adattato a bersaglio diversi domini del sistema nervoso embrionale. Noi dimostrare che utilizzando questa tecnica, si può avere come bersaglio l'embrionale telencefalo, diencefalo e della retina. Risultati rappresentativi sono presentati, in primo luogo che mostra l'uso di questa tecnica per introdurre costrutti espressione del DNA nei ventricoli laterali, che ci permette di monitorare la maturazione progenitrici, la differenziazione e la migrazione nel telencefalo embrionale. Mostriamo anche che questa tecnica può essere usata per bersaglio del DNA per i territori circostanti diencefalo il 3 ^° ventricolo, consentendo le rotte migratorie di differenziarsi in neuroni dei nuclei diencefalo da monitorare. Infine, abbiamo dimostrato che l'uso di micromanipolatori ci permette di introdurre con precisione i costrutti del DNA in aree bersaglio piccolo, incluso lo spazio sottoretinico, che ci permette di analizzare gli effetti della manipolazione dell'espressione genica per lo sviluppo della retina.