스프 레딩 우울증을 사용하여 에피소드와 만성 두통의 신경 면역 신호를 모델링 체외에서</em

여러 지점 뇌 조각의 면역 관련 SD 신호의 성공 유학 강조 가치가있다. 첫째, 시작 자극이 동기 SD를 시작 회색 물질 두뇌의 충분한 볼륨을 depolarize해야합니다. 이것은 인터페이스 구성 (즉, 슬라이스 문화 삽입 이상 유체에만 아래에 노출 및 가스 교환)이 필요합니다을 의미합니다. 1,2 둘째, 급성 뇌 조각은 SD하지만 그들의 준비에서 외상뿐만 아니라, 95 % – 산소 aerated의 사용을 유지 hippocampal 슬라이스 문화가 이러한 급성 슬라이스 한계를 극복하면서 링어의 솔루션은, 신경 회로 기능과 면역 항상성을 변경할 수 있습니다. 3 번째는 각각 프로 염증 변화와 epileptiform 동작을 생성, 그것은 슬라이스 문화 전에 적절한 기간 동안 유지되어야합니다하는 것이 중요합니다 microglia과 astrocytes가 정지 될 수 있도록 (즉, 체외에서 이상 십일)을 사용합니다. 3-5 마지막으로, SD는 살균 및 무균 기술을 사용하여 유도한다. 아래에 설명된 기술은 이러한 요구를 충족하도록 설계되었습니다. 1. 슬라이스 문화에 우울증을 확산 문화 준비 및 유지 보수. 슬라이스 문화가 같은 이전 매체 사소한 수정 8 설명한 말이 혈청 기반의 중간 또는 혈청없는 매체 (SFM) 6,7의 준비, 유지됩니다. 부화 매개 변수 36아르 ° C 5 % CO 2 95 % 습도 균형 공기. 우리는 문화가 체외 18 일 후에 SFM로 변환하고, 여분의 칼슘과 마그네슘을 포함 우리의 이전에 정의된 SFM을 사용하여 체외에서 적어도 35 일 이내에 유지 수있는 것을 발견했습니다. 또한, 항생제와이 antifungicide 여러 녹음 에피소드와 관련된 전염성 오염을 방지하기 위해 추가됩니다. 이것은 장기 (또는 녹음) 중간 제제가 포함되어 있습니다 (100 ML 당) : Neurobosal 중간, 97 ML, 겜 – 21, 2.0 ML; Glutamax (200 ㎜), 0.5 ML, Gentamycin (10 MG / ML), 10 μL; D – 글루코오스 (45 %), 680 μL, 아스코르비 산 (0.5 M), 100 μL, Fungizone, (250 MG / ML), 400 μL, NaCl (5.0 M), 820 μL, MG 2 Club 호텔 2 (1.0 M) , μL 80, CaCl 2 (1.0 M), 160-240 μL. 문화가 체외에서 21-35일에서 SD에 사용됩니다. 활력 확인. 3,6,7 문화는 사용하기 전에 피라미드 신경 세포 사망의 증거에 대한 검사를하고 있습니다. 체외 18 일 동안, 삽입 5 μm의 Sytox 그린, 그것이 DNA (즉, 죽은 세포로 침투하여)에 바인딩하면됩니다 형광 마커를 포함하는 매체 20 분 (일반 배양 조건)에 대한 incubated 수 있습니다. 삽입물은 그들의 이전 중간에 다시 전송 및 CA3 또는 CA1 피라미드 뉴런의 계층 부상의 증거에 대한 형광 현미경 (504 여기와 523 방사)을 조사하고 있습니다. 20 개 이상의 셀 또는 250 IU 이상의 형광 이상의 표준 수준의 조각은 더 이상 사용에서 제외되었습니다. 재료 제조. 그라운드 전극은 유리 튜브 (2.0 mm OD / 1.16 mm ID를) 4.5 mm 길이로 잘라 만든 그리고 잠시 양쪽 끝에 불을 연마하고 있습니다. 우리는 년 이상 지난 수있는 시간에 약 20 전극을합니다. 끓기 1M KCl 100 ML 준비하고 맑은 노란색 솔루션을 생산 교반, 3.5 g의 한천 및 0.5 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (ethylenediaminetetraacetic 산성 나트륨 소금 이수화물)과 함께 추가합니다. 유리 튜브뿐만 아니라 유연한 튜브로 가까운 거리에 따뜻한 KCl / 한천 솔루션을 그려 각 유리관을 통해 장착되어 유연한 튜브의 짧은 길이를 사용합니다. 릴리스 흡입과 KCl / 한천은 유리관의 열린 끝을 밖으로 천천히 똑 수는, 다음 얼음 조각에 대해 열려있는 유리 튜브 끝부분을 잡아. 후자 작전 전극 끝에 젤로 한천을 프롬프트가 아닌 젤 최대 유리관에 다시 후퇴 후 것입니다. 한천이 차가운 실행 물 속에 gelled되면, 유연한 튜브가 유리 튜브의 위치를​​ 변경하지 않고 한천 제거할 수 있습니다. 1.5 ML의 원심 분리기 튜브 랙의 각 우물에 1 M KCl 장소 0.5 ML. 그런 다음 각각의 우물에서 각 한천 / KCl 채워진 유리 튜브 중 하나 팁을 놓으십시오. 다음 hemostat와 15 게이지 실버 와이어 80cm 길이를 유지하고 카운터 가기 개최 에머리 보드를 통해 와이어 근근이 살아가고하여 사면 각각 청소. 4cm 길이로 철사를 잘라 청소 은색 표면을 통해 회사 AG – AgCl의 코팅을 배치 20~30분 위해 표백제로 가득한 섬광의 약병에 그들을 놓으십시오. 반으로 각 와이어 벤드 및 Wi 가득 유리관의 한쪽 끝을로 무료로 종료를 삽입회 KCl / 한천, 노출 4-6밀리미터에 대해 떠나. 마지막으로, 코트 실버 와이어와 건조에서 KCl / 한천을 방지하기 위해 죽을있는 와이어의 작은 범위, 방수 및 유연한 접착제를 포함하는 유리 튜브 생크. 모든 전극에 대해 반복합니다. 접착제가 밤새 건조하자. 4 전극을 저장 ° 섬광 튜브 안에 C (5-6 전극 / 유리병) ~ 5 ML 1 M KCl과 현저하게 박테리아 성장을 retards EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 25 MG를 포함. 필라멘트 (비디오 그림 1)와 borosilicate 유리 튜브, 녹화 전극은 1.5 mm 직경 (10cm 길이 0.86 mm ID가)에서 만들어집니다. 샵 포인트로 뽑아 짧은 유리 튜브 훌륭한 팁을에 microelectrodes을 당기세요. 우리는 일반적으로 전극에게 당겨 1cm 테이퍼와 길이 ~ 7.5 cm. 이것은 적절한 위치와 전극 팁 시각화 수 있습니다. 전극은 Narishige PE – 2 풀러로 뽑았 수 있습니다. Microelectrode 도움말은 보정 광학 마이크로 미터가 장착되어 복합 현미경을 사용하여 시각화에 따라 2-4 μm의 다시 고장입니다. 우리는 표준 유리 조직학 슬라이드의 가장자리 (25 X 75 X 1mm) 부드럽게 microelectrode 도움말을 망가뜨릴 수있는 또 다른 3 차원 조작하는 사람에 의해 실시 유압 한 차원 micromanipulator에 첨부.를 사용하여 첫째, 전극은 점토를 사용하여 현미경 슬라이드에 첨부 마운트됩니다. 다음 슬라이드는 유압 조작하는 사람에 부착된 하락 유리의 가장자리 근처 microelectrode 팁을 이동하는 데 사용되는 현미경 슬라이드 홀더에 배치됩니다. 마지막으로, microelectrode의 끝 부분이 부드럽게 hydraulically 구동 현미경 슬라이드 모서리에 대해 그것을 눌러 고장입니다. 자극 전극 때문에 와이어 바이폴라 전극을 꼬인 위치 : 그들은 달리 monopolar의 자극에서 자극 유물로 덮여 될 evoked 현장 잠재력의 녹음 수 있습니다. 양극성 자극 전극은 부드럽게 날카로운 날붙이 바이폴라 전극과는 달리, 부상없이 이가있는 이랑의 표면에 적용할 수 있습니다. 마지막으로, 현재 적용 전극에 사용되는 테플론 절연 와이어의 가로 (베어) 원형 표면화된 것입니다. 와 테플론 코팅 와이어, 자극 전극 제조가 절단 ~ 20 백금 – 이리듐의 cm 길이 (200 μm의 직경이 125 μm의 코팅 노출된 직경)로 시작합니다. 그렇다면, 절반 길이를 구부와 와이어의 끝을 매듭에서 ~ 2cm를 남기고 느슨한 광장 매듭에 미심쩍은 부분을 묶어. 테이블에 놓여 전기 핸드 드릴의 척의 매듭을 고정합니다. 와이어가 단단히 꼬인 때까지 hemostat로 전선의 다른 쪽 끝을 잡고 있지만, 간단하게 (즉, 각각의 절단 표면은 전선이 무너지고없이 가로 방향으로 절단하고 다른 동등한 거리 될 훈련을 켜고 끌 ). 다음, 백금 – 이리듐 트위스트 전선의 맨 끝이 자극 아이 솔 레이터에 자극 전극을 연결하는 데 사용되는 전선을 이끌 첨부해야합니다. 이것은 ~ 50cm 30 게이지 와이어에 백금 – 이리듐 철사의 납땜 무료 끝을 통해 이루어집니다. 첫째, 벤치 탑과 뒤틀린 와이어 중 하나를 무료로 끝을 넘는 집중 HCL의 웅덩이를 드롭하는 테이프 백금 – 이리듐 트위스트 와이어. 다음, 와이어 커터를 사용하여 각 와이어의 절연의 1cm에 대해 해제 스트립. 꼬인 와이어 엔드에 인접한 리드 와이어에 송두리째 끝부분을 놓고 두 전선에 단단히 부착 때까지 미세 밀고 납땜 인두에서 다음 열을 솔더를 적용합니다. 노출된 전선 연결을 통해 열 수축 튜브의 작은 길이를 살짝하고 열을 맞게 축소. 두 번째 와이어를 위해 반복합니다. 15cm 파스퇴르 피펫의 팁을 폴란드어과 뒤틀린 protrudes의 약 6 cm보세요 때까지 피펫 아래 트위스트 백금 – 이리듐 와이어를 안내 화재. 전극의 양쪽 끝을 밀봉하기 위해 물을 혐오감을 에폭시 (예 : JB 용접)를 사용합니다. 마지막으로, 자극 아이 솔 레이터에 연결하기위한 리드 와이어 엔드에 바나나 플러그를 연결합니다. 입체 관찰에서 PBS에서 전극 팁을 배치하고 전극 팁만을 절단 끝에서 오는 electrolytically 생산 거품이 있는지 확인하십시오. 모든 거품이 꼬인 와이어의 측면에서 오는 경우, 다시 설정 그대로 절연하기 위해 전선 긴 축에 새로운 하나의 에지 면도날을 사용하여 가로 절단과 전극를 잘라. 이소성 자극 효과를 해결하기 위해 문제를 해결하면 자른 전극 팁 만들기보십시오. 녹음 요리로 구성되어 있습니다약 1.0 cm 간격 간격이 1.0 X 12mm 유리 막대에 앉아 35mm 문화 접시에 이가 문화 넣습니다. 유리 튜브를 가열 후 집게와 함께 바닥으로 그들을 눌러 요리베이스에 유리 봉을 연결합니다. 정적 기록 조건은 접시 중간의 1.5 ML를 추가합니다. 다음 매체의 1.0 ML에서 무균 면화 ~ 10mm 폭 3-4cm 긴 기사를 만끽해보세요. 긴 축을 따라 절반으로 면화를 접어 살균 포셉와 삽입의 내부 잘 따라 그것을 놓으십시오. 젖은 커튼 요리 습도를 유지하는 데 도움이됩니다. 관 세 압축할 4mm 길이가 균일하게 삽입 주위 간격입니다. 가스 교환을 허용 폴리 염화 비닐 필름과 단단히 요리를 커버. 초과 폴리 염화 비닐 필름을 제거하는 단일 에지 면도날과의 중간 수직 벽 주위를 잘라. Electrophysiological 설정 슬라이스 문화 삽입 조립은 electrophysiologic 레코딩에 대한 PDMI 녹음 챔버에 배치됩니다. PDMI 챔버에 삽입 / 문화 요리 조립이 필요로 기록 전극, 중형 유입 / 유출 튜브 등 다양한 위치에 작은 구멍, PDMI 챔버와 함께 제공되는 2mm 두께 플라스틱 디스크에 의해 덮여 있습니다 우리는 주기적으로 T 열전대 프로브가 7.3 산도와 36.0 ° C 조건을 보장하기 위해 봉인된 세미 microelectrode에 탑재된 소형 유형 모형 조합 산도 전극과 온도와 중간 산도를 모니터링합니다. 삽입 / 챔버는 5 % 이산화탄소 균형 공기와 매체가 중 정적 또는 35-36에서 열린 삽입 센터와 흐름 (1.2 ML / 분) 구성에서 개최됩니다 ° C.와 aerated입니다 흐름 조건, 중간은 36의 기록 챔버의 중심을 유지하기 위해 다시 인라인 히터로 따뜻하게 있습니다 ° C. 압력 완화와 연동 펌프 시스템은 펌프의 pulsations 않고 슬라이스 문화에 매체를 제공합니다. PDMI 챔버와 함께 제공된 흡인기는 부드러운 흡입을 통해 삽입에서 매체를 제거하는 데 사용됩니다. 안정성 들어, 챔버는 거꾸로 현미경을 보유하고 진동이없는 테이블에 앉아 특별히 고안된 버레이 – 지브롤터 바뀌 현미경 무대에 장착할 수 있습니다. 작은 구멍은 작은 배터리로 작동하는 소작 도구와 폴리 염화 비닐 삽입 랩을 통해 열립니다. 다음 흐름 구성이 사용되는 경우 유입 및 배출구 흐름은 접지 전극의 배치에 의해 다음, 시작합니다. 그렇지 않으면, 단순히 장소에 접지 전극을 넣어. micromanipulators과 장소에서 개최되는 전극은, 그냥 슬라이스가 5 배 확대 (그림 1)에서 거꾸로 현미경으로 시각 위에 위치하고 있습니다. 자극 전극 다음 기록 전극으로 시작. 우리는 microelectrode은 슬라이스와 접촉하게되면 참고로 오디오 모니터를 사용합니다. 끝 CA3 피라미드 세포 몸 레이어 따라 미드에 위치합니다. 녹음이 시작되며, 다음 자극 전극은 부드럽게 이가있는 이랑의 미드 표면에 감동입니다. 두 경우에서 초기 전극의 움직임은 거친 컨트롤과 함께 달성하고 있으며, 그 세포 몸 레이어 쉽게 구분할 수 있도록 최종 위치는 유압, 고급 컨트롤 위상 콘트라스트 조명을 사용합니다. 직접 미세한 시각화 미만 ~ 25 μm의 증가로 사전에 전극. 일단 전극은 조직을 접촉 전극 다른 20-30 μm의를 사전. 자극 전극이가 SD가 게재되지 않는 특정하는 장소에 넣어되기 전에 녹음 (즉 기계적 자극을 통해) 시작됩니다. 실험이 시작되기 전에 ~ 10 분 경과 수 있습니다. Transynaptically SD를 유도. 최적화는 (그림 2) 다음과 같이 CA3 필드 잠재력을 evoked. CA3 필드 가능성은 반응을 (예를 들어, ~ 1-5 μA) 트리거 충분합니다 현재 100 μs 펄스 (0.2 Hz에서) 시작과 함께 evoked 있습니다. 필드 잠재력이 최대한 때까지 피라미드 신경 세포 긴 축을 따라 단위로 기록 전극을 이동합니다. 그런 다음,이 위치에 기록 전극과 전류를 증가하고 최대한의 전류 응답을 (예를 들어, ~ 10-20 μA) 참고. 마지막으로, (예, 가짜 제어 정기적인 자극) 실험 하프 최대한의 자극 강도를 사용합니다. synaptically evoked SD (그림 2)에 대한 임계값을 결정합니다. 구성된 전극과 같이 evoked 필드 잠재력에 대해 위에서 설명한와 함께, 단일, 수동 evoked 파열하는 자극의 패러다임을 전환10 펄스 (10 Hz에서 @ 100 μs / 펄스)의 패러다임은 이전 전체 동물 연구에 적용. SD가 실행 때까지 점차적으로 자극 버스트 당 현재의 강도를 향상시킬 수 있습니다. 자극 사이에 적어도 60-120 잠깐 만요. 꿀롱의 보고서 SD 한계 (즉, 현재 X 시간). 여러 SDS의 유도에 반응을 측정해야합니다 다른 실험에서, SD를 보여주고 가능성이 자극 강도를 사용하여 (예를 들어, ~ 100-500 NC). 시간 트리거 SD 매일 9 분. 실험을 통해 무균 기술을 사용해야합니다. 마지막 SD 후, 정상적인 배양 조건에 문화의 삽입을 반환합니다. SD 경험 문화를 참고 문화 요리를 표시합니다. 우리의 습관은 왼쪽에서 오른쪽으로 # 1, # 2, # 3와 같은 세 가지 문화의 각각을 지적, 왼쪽 및 슬라이스 문화 삽입의 오른쪽에 두 자국을 한 표시를하는 것입니다. 문화 수확까지 모든 3~4일 매체 변경합니다. 회귀 SD 들어, 위에서 설명한 절차를 따르십시오. 우리는 일반적으로 여러 SDS의 초기 시간 이후 SD 임계값 1, 3, 7, 14 일 변화 테스트합니다. CA3 영역 빠르고 잠재력과 느린 잠재적인 변경 사항은 별도의 디지털 신호 처리 시스템을 통해 기록됩니다. 2. Hippocampal 슬라이스 문화의 전형적인 바이탈 이미징 상주 면역 세포 (즉, microglia)의 동적 기능 동작은 마찬가지로 세포 부상이나 면역 활성 ​​(그림 3)하지 않고 슬라이스 문화에 모니터링할 수 있습니다. 9 예를 들어, SD의 시냅스 활동의 변화와 관련된 움직임을 평가할 수 microglia 레이블을 위해, 우리는 isolectin – IB 4 형광단 – 태그 사용됩니다. 이가의 양이온 (0.1-1.0 MM)이 microglial 세포 점막에 α – D – galactosyl moieties에 렉틴 바인딩하는 데 필요한 있기 때문에 "렉틴 PBS는"추가 양이온과 PBS (0.1 MM 각 CaCl 2, MgCl 2, MnCl 2)입니다. "렉틴과 PBS"의 솔루션을 확인하십시오 : 1 L PBS 들면, 무균 여과 기술과 멸균 사용 추가 1M MgCl 2 100 μL 1M MnCl 2 100 μL 1M CaCl 2 100 μL ° C.를 결합하고 4 냉장 보관을 철저하게 믹스 "렉틴과 PBS"의 단 500 μL는 isolectin의 유리병 당 필요합니다,하지만 냉각하고 한 번에 개월 유지 수 있기 때문에, 그것은 더 큰 볼륨을 만들 유용할 수 있습니다. Reconstitute AlexaFluor는 isolectin – IB4 (isolectin) 분말 '렉틴 PBS "에 to1 MG / ML을 동결 건조된 594 – 태그. photobleaching 최소화하기 위해 조명 노출을 최소화, 최대한 빨리이 단계를 수행합니다. Isolectin 20 μL에 aliquoted 수있는 것은 한번 1mg/ml의 재구성 및 하나의 년 -20 ° C에서 보관. 20 4-10시간 이미징 전에 정상적인 배양 조건에서 성장 매체와 부화 슬라이스 문화에 μg / ML에 isolectin을 희석. 이미징는 설정. 현미경, 셔터, 카메라, 라이트, 2.0 중립 밀도 필터, 36 ° C, 가스 : : 5 % CO2, 공기 (또는 20 %의 산소, 질소 균형) 영상 세트 업으로 구성되어 있습니다. 현미경, 카메라, 자외선, 온도 제어, 가스 이미징 전에 최소 1 시간을 켭니다. MetaMorph 이미징 프로토콜을 설정합니다. '저널'드롭 다운 메뉴에서 저널을 실행 "을 선택 …". 이것은 "모션 W – var에 AFS을 (저널 이전에 그 다음 단계를 따라 설치)"를 선택합니다있는 저널 폴더의 오프닝을 프롬프트해야 "열기"를 클릭합니다. "자동 초점 주파수"창이 1 번호를 유지, 다음 나타납니다, "OK"를 클릭합니다. 다음, 설정 "순차 파일 나 …" 창이있는 그대로 모든 것을 계속 팝업됩니다 자료 이름 : 이미지; 이미지 번호 : 1; 번호 폭 : 3; 형식으로 저장 : MetaMorph TIFF; 이미지가 이미 존재하는 경우 -> 자동으로 덮어 씁니다; "를 선택 디렉토리 …",이 발생합니다"폴더에 대한 찾아보기 "창이 팝업으로를 클릭합니다. 여기, 영화 프레임을 저장해야하는 폴더를 (또는 새 폴더를 만듭니다)를 선택합니다. 그런 다음 올바른 폴더는 경우 (예 : C : \ 데이터 \ 새 폴더)의 하단에 표시됩니다 "설치 순차 파일 나 …" 창, "확인"을 클릭합니다. 수집 창에서 : DiIMGBIN2으로 왼쪽 하단 모서리에있는 설정을 선택합니다; "노출 시간": 20ms, "비닝"1. 그런 다음, 특별 탭에서 : "센서 모드"FT; "Digitizer "10MHz (EM 게인); "이득"Gain3 (배); 노출에 대한 열기, 지우기 모드 : CLEAR 예약 EXP, 클리어 횟수 : 2, 트리거 모드 및 라이브 트리거 모드 : 일반 (시간 초과) 카메라 셔터, "45 그들이 이득"을 선택하십시오. "평균 프레임"3. "닫기"를 클릭하십시오. MetaMorph 이미지를 설정 후, 아래의 두 1mm 유리 막대와 35mm 문화 접시에 삽입을 놓으십시오. 플레이스 더욱 삽입을 안정화하기 위해 삽입하고 문화 요리의 벽 사이에 장착되어 고무 튜브 세 2mm 조각. humidified 환경을 유지하기 위해 삽입 안에서 추가 1 ML 매체에 배어 면화 ~ 10mm 폭 조각을 놓으십시오. 그것은 벽 플러시하고 멀리 hippocampal 조각에서 있는지 확인합니다. 유체 손실을 방지하기 위해 폴리 염화 비닐 필름과 밀접하게 문화 요리의 상단 커버. 이미지의 초점이 CA3 피라미드 세포 층 있는지 확인합니다. 5 배, 10 배, 그리고 20x에서 위상 사진을 찍고하여 슬라이스의 오리 엔테이션을합니다. 화면에 나타나는 "초점을 찾기"창에서, 설정 범위는, 현재 + / – (맨 아래에있는 확인란을 모두 선택되어 있어야 함) "1"로, 미크론 (S)에서, "8"수 있으며, 정확성 . 포커스에있는 이미지를 보장하기 위해 "포커스 찾기 '를 클릭합니다. "Timelapse을 습득"창에서, 시간 간격 "일분"로하고, "6시간"(이들은 우리의 선호하는 인수 파라미터)로 기간을 선택합니다. 정확하게 microglial 움직임을 캡처하려면, 영상 한번 분당보다 자주도 없어야합니다. 이미지 저장소에서 스택을 선택합니다. 업데이트 이미지 창 상자가 아닌 다른 두 상자 아래 체크하지만,해야합니다. "Illum" "람다"으로를 선택합니다. "확인"을 클릭하십시오. 영화는 이제 게재됩니다. 이것은 다른 아무것도 당신이 영화가 그 다음 시간 초과 인수 단계에서 중단됩니다 그 이후 Esc를 눌러 초기 동영상을 멈출 때까지 영화 종료될 때까지 또는 MetaMorph 프로그램 내에서 수행할 수 없습니다 의미합니다. 영화의 마지막으로 (A) 위에서 언급한 Sytox 심사에 의해 세포 손상이 있는지 확인합니다. 3. 낮은 수준의 시토킨가 11-15 신호를위한 RNA 추출 우리는 이전에 낮은 수준의 시토킨은 qPCR와 PCR 어레이 기술을 사용하여 슬라이스 문화에 신호의 검출에 대한 자세한 지침을 제시. 6,7 우리는 현저하게 슬라이스 문화에 시토킨 mRNA 탐지를위한 방법의 감도를 개선하고 여기에 개선을 제시했습니다. 개선, 예를 들어,에 대한 검색을 ~ 6 이전 기법보다 더 중요한 시간과 허용 아르 종양 괴사 인자 알파 (TNF – α) 변경하고 cDNA preamplfication에 대한 샘플 prescreening 조직 수확 및 RNA 격리하기 위해 접근을, 포함 슬라이스 문화 인터페론 – 감마의 첫 번째 시간 (IFN – λ)가 감지. 15 PCR 준비. 슬라이스 문화 수확. 다음 실험, 슬라이스 문화 삽입은 ° C 이상 처리까지 최대 3 일이 나중에 2-3 ML RNA에 빠져들 4에 저장됩니다. 수확하려면 (즉, 적절한 해마에 인접한 모든 조직) 다이아몬드 칼을 이용하여 조직을 외부 제거하고 벌금 밀고 페인트를 사용하여 호수 (PBS)를 버퍼 0.5 ML 멸균 인산을 포함하는 개인 RNase / DNase 무료로 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 조각 리프트 브러쉬. stereotypic 패션 스핀 샘플 (10,000 RPM X 1 분) 모든 조각들이 튜브의 동일한 측면을 준수 있도록. 500 μL의 PBS TRIzol 뜨는 및 resuspend 샘플을 제거합니다. 스토어 샘플 -80 ° C에서 또는 RNA 추출까지 얼음 계속. 혼자 키트의 사용보다 큰 RNA 수율 (그림 4)에서 RNeasy 마이크로 키트 결과와 RNA 추출 usingTRIzol. TRIzol – 샘플을 해동 5 분 실온에서 알을 품다. 단단한 조직이 더 이상 표시되지 않습니다 때까지 1 ML과 샘플을 그림 아래로 조직을 떼어 놓다 것은 pippetor 및 / 또는 vortexing을 밀고. 100 μL RNase 무료 (RF) 클로로포름을 추가하고 관에게 섞어 2-3 번 반전. 모든 분 vortexing, 방 온도에서 3 분 알을 품다. 4 15 분 13,000 rpm으로 원심 분리기 ° C. 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는 전송합니다. 인터페이스를 방해하지 않도록주의하십시오. 실온의 동일한 볼륨 RF 70% 분자 생물학의 등급 에탄올을 (~ 300 μL) 추가합니다. 몇 번 아래 pipetting과로 가볍게 섞는다. RNeasy 마이크로 키트 방향마다 다음 단계를 계속 : 2mL collectio에 배치 RNeasy 마이크로 열 샘플을 적용N 튜브. 흐름 -을 통해 폐기, 15 초 10,000 rpm으로 원심 분리기. 350 μL 버퍼 RW1와 RNeasy 컬럼을 씻으십시오. 흐름 -을 통해 폐기, 15 초 10,000 rpm으로 원심 분리기. 70 μL 버퍼 RDD 10 UL DNase 1 재고 솔루션을 추가 부드럽게 섞는다. 직접 멤브레인에 DNase 솔루션의 80 μL를 적용 20 분 실온에서 알을 품다. 350 μL 버퍼 RW1와 RNeasy 컬럼을 씻으십시오. 흐름을 통하여 튜브 폐기, 15 초 10,000 rpm으로 원심 분리기. RNeasy 칼럼 500 μL 버퍼 RPE를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기, 15 초 10,000 rpm으로 원심 분리기. RNeasy 칼럼 500 μL RF 80% 분자 생물학의 등급 에탄올을 추가합니다. 2 분 10,000 rpm으로 원심 분리기, 흐름을 통해 그리고 튜브 폐기. 뚜껑 열고 새로운 튜브에 RNeasy 열의를 배치합니다. 5 분 최고 속도 (즉, 14,000 RPM)에서 원심 분리기. RF의 microcentrifuge 관에 RNeasy 컬럼을 전송합니다. 직접 멤브레인 14 μL RF 물을 적용합니다. elute 1 분 10,000 RPM에서 원심 분리기. -80에서 보관 샘플 ㆍ 또는 다음 단계를 계속 C. RNA의 양을 정함. RF 1X 트리스 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 RiboGreen 1:200 (TE) 버퍼를 희석. RNA 표준으로 사용되는 효모 tRNA를 준비합니다. 작업 재고는 100 μg / ML에서 -20 ° C에 저장됩니다 1 μg / ML (990 μL TE 10 μL)로 희석. 다음과 같은 기준을 만듭니다 : 60 μL / NG, 60 μL tRNA 40 μL TE를 추가 용, 100 μL / NG,, 100 μL를 추가 80 μL / NG, 80 μL tRNA 20 μL TE를 추가 40 NG / μL 20 μL / NG 20 μL tRNA 80 μL TE를 추가하고, 0 μL / NG 100 μL TE를 추가를 위해, 40 μL tRNA 60 μL TE를 추가합니다. 샘플 준비 : 99 μL TE + 1 μL 샘플을 결합합니다. 중복 각 샘플을 실행합니다. 멀티 채널 pipettor를 사용하여, 당 잘 희석 RiboGreen 100 μL를 추가합니다. 믹스로 최대 피펫합니다. 접시 리더에서 형광을 측정합니다. 플루오레신 (485 nm/535 NM, 0.1 초) 프로그램입니다. Excel 스프레드 시트에 결과를 내보냅니다. RNA 농도를 결정합니다. 그래프 흡수 대 RNA 농도 및 Excel에서 가장 적합한 선형 회귀 선을 만듭니다. 가장 맞는 라인과 관련된 회귀 방정식에서 샘플 RNA의 농도를 확인합니다. RNA 품질을 확인합니다. Ribosomal RNA 밴드 무결성은 아가로 오스 겔 (그림 4)을 통해 측정됩니다. 그것이 (= RNA 1 μg가 필요하고 우리의 수율이 작은이기 때문에) 얻은 각 RNA 샘플의 일부를 실행하는 허무지만, 그것은 주기적으로 증거로 모범적인 샘플을 denaturing 아가로 오스 겔을 실행하는 것이 좋습니다되는 방법 , 정상적으로 완료되면, 고품질의 RNA (즉, 열화없는)이 산출. 1 % 아가로 오스 겔을 (100 ML 볼륨에 대한) 준비. 있든 트레이와 RNase와 젤 빗 철저히 주조, 전기 탱크를 청소합니다. 플라스크에 ultrapure 아가로 오스의 1g을 나가는거야. RNase 무료 물과 10X 맙스 10 ML 83 ML 추가 [3 – (N – Morpholino) propanesulfonic 산성] 버퍼와 전자렌지 아가로 오스는 해산 및 솔루션 (~ 3 분) 분명 때까지. 10X 맙스 버퍼를 만들려면 83.7 g의 걸레, 13.6 g의 아세트산 나트륨 및 3.7 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 결합합니다. RNase 무료로 물 800 ML 추가 디졸브로 섞는다. 7.0 산도를 조정하고 1 L.로 작성 소독이나 압력솥을 필터링합니다. 상온에서 보관, 빛으로부터 보호. 젤 55 냉각 허용 ° C 7 ML 37 % 포름 알데히드 (이 단계는 화학 퓸 후드에서 수행되어야합니다)을 추가합니다. 트레이를 주조로 젤을 붓고, 그리고 후드의 응고에 젤 수 있습니다. RNA 샘플을 준비합니다. RNA 샘플 버퍼 (500 μL, 신선한 확인). 50 μL 10X 걸레, 250 μL 포름 아미드, 90 μL 37 % 포름 알데히드, 108 μL RF H ​​2 O 2 μL ethidium의 브로마이드 (재고 솔루션 10 MG / ML)를 결합합니다. RNA 중 1-10 μg하려면 3 배 희석을 위해, 샘플 버퍼를 사용하여 볼륨을 두 번 추가합니다. 95 °에서 변성 후 5 분 C, 그리고 5 분 얼음 진정해. 스핀 BRiefly 그리고 (원하는 경우 로딩 염료 추가) RNA의 사다리와 함께 우물에 전체 샘플을로드합니다. Electrophorese 1X 맙스 버퍼와 챔버를 입력합니다. 마커까지 50-75 볼트에 Electrophorese은 젤의 2/3rd 길이에 대한 마이 그 레이션했습니다. UV transilluminator에서 젤 시각화. 28S 대역은 18S 밴드 (그림 4) 두 배나 강렬한 것을 날카로운 18S와 28S ribosomal RNA (rRNA) 대역이있다는 것을 확인합니다. 타락한 RNA는 더럽혀 지긴했지만 … 모양, 솜털 밴드가, 아니면 2시 1분 비율을 전시하지 않습니다. 일반적으로 우리는 총 RNA의 품질을 평가하기 위해 광학 밀도를 사용합니다. Nanodrop 통해 것처럼 구분하지, 자외선 분광 광도법은 RNA 품질을 검사의 신속하고 비용 효율적인 수단입니다. 광학 밀도 (OD) 1.5-2.0의 280분의 260 비율을 찾습니다. RNA가 (TE 버퍼 대 물) resuspended되는 솔루션은 OD의 비율에 영향을 미치지는 점에 유의하십시오. PCR 활동. 사전 PCR 설정 특정 primers 디자인 NCBI의 Primerblast 사용 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/를 : 대상 유전자의 Refseq의 가입 번호를 입력합니다. 70-200 BP의 PCR 제품의 크기를 지정합니다. 순방향 및 역방향 primers 사이 미만 5 °의 차이가 55-72 °의 TM을 지정합니다. 게놈 배경을 줄이기 위해 "프리머는 엑손 – 엑​​손 접합부에 걸쳐해야합니다"를 선택하십시오. primers 추가 대상을 인식하지 않도록 랫 Refseq RNA 데이터베이스에 대한 특이성 확인을 활성화합니다. 다음 기준에 맞는 결과에서 프라이머 쌍을 선택 : 오랜 18-30 기지. 템플릿에서 분리 미만 2,000 기지. 40-60%은 구아닌 – 사이 토신 콘텐츠를 템플릿에 전처리 제의 안정적인 바인딩을 보장합니다. 참조 유전자를 선택. 아니 모든 참조 유전자는 실험이 설정에 적합합니다. 새로운 패러다임을 사용하는 때마다, 참조의 안정성이 확인되어야합니다. 일관성을 위해, 우리는 알티 2 파일러 PCR 배열에 제공되는 네 개의 참조 유전자 중 하나를 사용하기로했다. 좋은 참고 유전자는 다음 기준을 만족해야합니다 : 의 표현 수준은 실험 패러다임에 의해 변경되지 않습니다. 이것은 대상 유전자의과 비슷한 수준에서 표시됩니다. 적절한 참조를 선택하려면 : 시스템에 안정적인 참조 유전자에 대한 가능성이 후보자를 식별하는 문학을 검토합니다. 그것이 국소 빈혈의 연구에 안정 표시했기 때문에 예를 들어, 우리는 Rpl13a을 테스트. 11,12 디자인 primers은 위에서 설명한 (또는 RTPrimerDB 같은 데이터베이스의 일반적인 기준 유전자에 대한 이미 검증된 primers 찾기 http://www.rtprimerdb.org/을 ). (아래 참조) 대상 유전자 primers 함께 primers을 최적화합니다. 후보 참조 intragroup 분산에 따라 각 유전자에 대한 안정성의 가치를 계산하고 최소한 표현과 유전자 (들)을 선택 Normfinder (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm)과 같은 소프트웨어를 사용하여 가장 안정한지 확인 샘플을 통해 변화. 예를 들어, Rpl13a는 SD (그림 4)에 대한 최적의 참조 유전자입니다. primers를 최적화합니다. qPCR에서 일관성 있고 신뢰성있는 결과를 얻으려면, primers는 재현성, 감도 및 특이성의 특정 기준을 충족해야합니다. 각각의 새로운 뇌관 쌍을 위해 이러한 매개 변수를 테스트하는 것이 좋습니다. 재현성이 기술은 복제 실행에 의해 테스트됩니다. 감도는 연속 4 배 dilutions의 표준 곡선의 성능에 의해 평가하실 수 있습니다. 특이성은 용해 곡선 분석 및 겔 전기 영동 (그림 5)에 의해 단일 제품 확인에 의해 결정됩니다. 당신의 primers의 품질을 테스트하기 위해 qPCR 판, 그리고 사용할 수 primers의 농도를 실행합니다. 1 1시 4분, 1시 16분, 1:64, 1:256,없이 템플릿 컨트롤 (NTC) : 전체 – 뇌 RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하여 다음과 같은 표준 곡선을 (연속 4 배 dilutions 일련의) 만들기 . 각 희석 들어, duplica의 cDNA 1 μL를 실행primers 각 농도 (즉, 100 nm의, 200 NM, 300 NM)의 테. 기술 일관성 CT 값을주고 복제되었는지 확인합니다. 희석 곡선에 대한 CT 값을 검사합니다. dilutions 각 농도에 대한 CT 값을 플롯. 결과 그래프는 좋은 상관 계수 (즉,> 0.95)과 선형해야합니다. 단일 증폭 제품의 존재 (즉, 단일 피크)를 확인하기 위해 커브를 녹여 검사합니다. 거기에 여러 개의 봉우리가, 또는 산봉우리가 비슷한 경우, 이것은 오염, mispriming, 뇌관 이합체 – 유물 등 (그림 5) 제안 할 수도 있습니다. NTC의 절정 가능성이 높습니다 cDNA 템플릿의 부재에 더 쉽게 양식 뇌관의 dimers에 해당되며, 염려해서는 안됩니다. 1 % 아가로 오스 겔에서 증폭 제품을 해결하여 용융 – 곡선 데이터를 확인합니다. 1 % 아가로 오스 겔을 (100 ML 볼륨에 대한) 준비 플라스크에 아가로 오스의 1g을 나가는거야. 1X 트리스 – 아세테이트 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (태) 버퍼와 전자렌지 아가로 오스는 해산 및 솔루션은 명확 때까지 100 ML을 추가합니다. 1 L 50x 태 버퍼 2 M 트리스베이스 57 ML 빙초산과 0.05 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0)으로 구성되어 있습니다. 증류수 (: 40 MM 트리스 – 아세테이트 및 1.0 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 최종 농도)와 1X에 태 버퍼를 희석. 젤 ° C 0.5 μg / ML의 농도에 ethidium 브로마이드를 추가하기 전에 55 냉각 수 있습니다. 트레이를 주조로 젤을 붓고하고 실온에서 응고 수 있습니다. 실행하려면, 1X 태 가득 전기 챔버에서 젤 장소, 배의 로딩 염색 2 μL와 qPCR 판에서 샘플 10 μL을 결합 잘 혼합 및 분자량의 사다리와 함께 우물로로드합니다. 마커가 귀하의 cDNA 제품의 예상 크기에 따라, 적절한 거리를 마이 그 레이션 때까지 50-150 볼트에 Electrophorese. UV transilluminator로 시각화. 증폭된 PCR 제품이 당신의 목표에 적합한 크기의한지 확인합니다. 프리머 dimers 50 BP 근처에있을 것입니다. 에 대한 사전 검열은 TNF – α가 증가. TNF – α는 주변에 염증 반응을 시작 이후, 우리는 이것이 두뇌에도 적용하고 진행하기 전에 슬라이스 문화 면역 상태 (즉, 정상, 사기, 그리고 실험 집단)의 마커로서 TNF – α의 mRNA에 대한 초기 검사를 사용하여 의심 전체 PCR 배열 분석합니다. 정상과 가짜 제어 TNF – α의 mRNA 수준을 우리 실험실, 실험 (즉, 정상, 사기, 그리고 실험적인 그룹) 내에서 발견 interassay 범위가 아닌 경우 무시하고 전체 PCR 배열 분석을 진행하지 않습니다. iScript cDNA 합성. 20 μL의 최종 볼륨 4 배 μL 반응 혼합물, 1 μL 역방향 transcriptase, 25 NG RNA, 그리고 RF H ​​2 O : 각 RNA 샘플은 PCR 튜브에 아래와 결합. pipetting하여 부드럽게 혼합하여 간단히 스핀 다운. 부화 : 25 ° C, 5 분, 42 ° C, 30 분, 85 ° C, 5 분. 1시 4분을 (60 μL RNase 무료 물을 추가) 희석. -20 ° C에서 저장하거나 시간 이내에 사용할 때까지 얼음 계속. TNF – α에 대한 qPCR. 각각의 프라이머 쌍을위한 마스터 믹스를 준비합니다. 12.5 μL IQ SYBR 녹색, 샘플 당 1 μL 뇌관 믹스와 10.5 μL 물을 결합합니다. 우리 Rpl13a 및 TNF – α primers 모두 200 NM는 최적의 농도이다. 1.5 ML의 RF microcentrifuge 관에 primers 필요에 따라 살인자의 볼륨의 크기를 조정하고 번호판을 설치하는 동안 얼음 계속. 컨트롤 / 샴스 / experimentals와 qPCR 접시를 설정합니다. 각 유전자에 대한 중복의 cDNA 샘플 당 1 μL를 사용하십시오. 각 물론 귀하의 마스터 믹스 24 μL를 추가하고 혼합하고 아래로 피펫. 그들은 형광 신호가 방해하므로, 거품을 피하기 위해 매우주의하십시오. PCR 증폭의 40주기를 실행합니다 : 95 ° C, 8.5min; 40주기 : 95 ° C, 10 초, 60 ° C, 30 초, 72 ° C, 20 초 / 사이클. 각 55에서 시작 10 초에 대한 0.5 ° C 단위의 80주기 ° C.; 55 ° C, 1 분 : 커브를 용융 데이터를 (. ΔΔCt 방법, 그림 4) 분석 13. PCR 배열에 대한 cDNA 합성. RNA 250 NG를 각 샘플의 볼륨 (μL)을 계산. 당신이 일관되게 당신의 샘플에서 추출할 수 있습니다 RNA (100 NG 1 μg)의 금액을 선택합니다. 알티 2 퍼스트 스트랜드 키트 – 제조 업체의 지침에 따라 등. 간단히 : 해동 모든 시약을 스핀. 각 RNA 샘플의 경우, PCR 튜브에 다음을 결합 : RNA 250 NG, 배 게놈의 DNA (gDNA) 10 μL의 최종 볼륨 제거 버퍼와 물 2 μL. pipetting하여 부드럽게 혼합하여 간단히 스핀 다운. 42 ° C 5 분 알을 품다. 1 분 얼음 칠. 그 동안, 반대 전사 (RT) 칵테일 (사람마다 샘플) 준비 : 5 배 RT 버퍼 3, 1 μL 프라이머 및 외부 제어 믹스, 1 μL RT 효소 믹스 3, 물 3 μL 4 μL를 결합합니다. 각 샘플에 RT 칵테일 10 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. 42 ° C 15 분 알을 품다. ° C 5 분 95시 잠복기하여 반응을 중지합니다. 각 20 μL cDNA 합성 반응 (111 μL의 최종 볼륨에 희석)에 RF H ​​2 O 91 μL를 추가합니다. pipetting으로 잘 섞는다. -20 ° C에서 저장하거나 시간 이내에 사용할 때까지 얼음 계속. RT PCR이 프로파일의 배열입니다. 다음 지침은 제조 업체들을 따라 편의를 보시려면 여기를 되풀이하고 있습니다. 시약 준비 해동 모든 시약을 스핀. 실험 칵테일 준비 : 2X SABiosciences 알티 2 qPCR SYBR 그린 마스터 믹스, 희석 cDNA의 102 μL 및 2,700 μL의 최종 볼륨 RF H ​​2 O의 1248 μL의 1350 μL를 결합합니다. 조심스럽게 밀봉된 봉투에서 PCR 배열을 제거합니다. 로딩 저수지에 칵테일을 분배. 멀티 채널 pipettor 각각 잘 25 μL를 추가합니다. 조심스럽게 인감 PCR 배열 판. 상온에서 1 분 10,000 RPM에서 번호판을 원심 분리기. PCR 프로그램까지 얼음에 장소 준비가 된 것입니다. 컴퓨터에 적합한 자전거의 프로그램을 실행합니다. iCycler : 95 ° C, 10 분 40주기 : 95 ° C, 15 초, 60 ° C, 1 분. 곡선을 녹일 : 55 ° C, 1 분, 10 초마다 55에서 시작 ° C에 대해 0.5 ° C 단위의 80주기 데이터를 분석할 수 있습니다. 기본주기위한 "자동 계산"을 선택하십시오. 수동으로 임계값을 설정 임계값의 위치에 대해 "사용자 정의"를 선택하십시오. "로그보기"에서 증폭 줄거리의 선형 단계의 낮은 한 3 번째 임계값을 설정합니다. 임계값이 값은 실행에 걸쳐 동일하게 유지하셔야합니다. 데이터를 내보냅니다. 엑셀 파일에 입력. SABiosciences PCR 어레이 데이터 분석을 업로드합니다. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php 참조 유전자를 선택하십시오 – 우리는 Rpl13a를 사용합니다. 우리 연습하는 것입니다 : 최소한 중복 PCR 배열로 결과를 확인합니다. 3 배 배열 변경 사항은 이후의 구체적인 대상 PCR 증폭에 의해 확인 필요가 없습니다. 6,7 보다 3 배 변경 2X 변경 내용을 확인하기 위해 2-3 PCR 배열 (의 후속 특정 대상 PCR 증폭 또는 사용에 의해 확인되어야합니다. DNA 미리 증폭이 예상 초저 표현 (그림 6)과 목표를 분석하는 데 사용됩니다. SABiosciences의 알티 2 나노 PreAMP cDNA 합성 키트 및 프라이머의 믹스가 전체 PCR 배열을 실행하려면 샘플 RNA의 소량을 사용 (100-100 NG)를 허용하는 RNA의 사전 증폭위한 것입니다. 각 프라이머 믹스는 최소한의 편견과 89 유전자 특정 cDNA 대상 템플릿의 증폭을 허용합니다. 우리는 detectible 수준 등 IFN – λ와 같은 낮은 수준의 신호를 증폭하는 수단으로이 시스템을 사용하고 있습니다. 알티 2 나노 PreAMP cDNA 합성 키트 – 제조 업체의 지침에 따라 등. 간단히 : 해동 모든 시약을 스핀. 각 RNA 샘플의 경우, PCR 튜브에 다음을 결합. RNA 1 – 100ng, 10 μL의 최종 볼륨 배 gDNA의 제거 버퍼와 물 2 μL. pipetting하여 부드럽게 혼합하여 간단히 스핀 다운. 42 ° C 5 분 알을 품다. 1 분 얼음 칠. </lI> 그 동안 (샘플 당) RT 칵테일을 준비합니다. 5 배 RT 버퍼 3 4 μL, 1 μL 프라이머 및 외부 제어 믹스, 1 μL cDNA 합성 효소 믹스, 1 μL RNase 억제제, 그리고 물 3 μL를 결합합니다. 각 샘플에 RT 칵테일 10 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. 42 ° C 15 분 알을 품다. ° C 5 분 95시 잠복기하여 반응을 중지합니다. -20 ° C에서 보관 또는 사용 준비까지 얼음 계속. 특정 primers와 cDNA 증폭. PCR 튜브에 다음을 혼합 : 12.5 μL PCR 마스터 믹스, 7.5 μL 특정 primers하고, undiluted cDNA 5 μL. PCR 증폭 12 사이클을 실행합니다. 95 ° C, 10 분. 12주기 : 95 ° C, 15 초, 60 ° C, 2 분. 4 기다려 ° C. 각 샘플 2 μL 사이드 반응 감속기를 추가합니다. 37 ° C 15 분 알을 품다. ° C 5 분 95시 잠복기하여 반응을 중지합니다. 각 27 μL cDNA 증폭 반응을 84 μL RF 물을 추가합니다. -20 ° C에서 저장하거나 시간 이내에 사용할 때까지 얼음 계속. SAB primers와 위에서 설명한 것처럼 SYBR 녹색 마스터 믹스를 사용하여 개별 유전자 목표를 증폭. 4. 시토킨 신호의 다중 Phosphoprotein의 Assays Mutliplexed phosphoprotein의 assays는 시토킨 리간드 – 수용체 하류 신호 (그림 7) 정의하는 데 사용됩니다. 슬라이스 문화의 총 단백질의 양을 확인합니다. 부드럽게 한 ML 추위에 삽입과 장소의 조각을 리프팅하여 수확 슬라이스 문화 (4 ° C) PBS. 30 초 및 제거 PBS를위한 튜브를 원심 분리기. 드라이 아이스에 장소 수확 완료 때까지. -80에서 보관 ° C. 총 단백질 분석을위한 슬라이스 문화를 균질. 제조 업체의 지침에 따라 세포 용해 버퍼를 준비합니다. 버퍼의 총 볼륨 프로 테아제 억제제를 추가 각 슬라이스 문화에 용해 버퍼의 최소 200 μL를 삽입했습니다. 예를 들면 다음과 같습니다 팩터 1, 팩터 2, DMSO 500 MM PMSF 20 μL 4.95 ML 세포 용해 완충액을 10 μL의 20 μL를 추가합니다. 얼음 200 μL 용해 버퍼에 슬라이스 문화를 녹여. 1 초 펄스에서 슬라이스 문화 다섯번 Sonicate 다시 얼음 바로 놓으십시오. 10 초에 대한 와동 샘플. 4 견본을 원심 분리기 ° C를 13,000 rpm으로 15 분. 깨끗한 튜브에 뜨는 전송 얼음 계속. 총 단백질 분석을 수행합니다. 단백질 표준을 준비합니다. Reconstitute 재고 소 제조 업체의 지침에 따라 (BSA) 알부민 혈청. 0에서 1,000 사이 μg / BCA 단백질 분석을위한 고순도 물에 희석 ML까지 표준을 준비합니다. 작업 시약의 계산 볼륨 샘플의 수를 기반으로 복제했습니다. 예를 들면 다음과 같습니다 (8 표준 + 18 알 샘플) X (2 샘플 당 복제) X (잘마다 필요한 0.2 ML 작업 시약) microplate에 로드된 모든 샘플에 필요한 = 10.4 ML 총 볼륨. 충분한 볼륨을 보장하기 위해 12 ML 총 볼륨 최대 라운드. 혼합 시약이 작업을위한 시약 시약 A와 B, 일부 탁도가 발생할 수 있지만, 곧 사라 해야지. 샘플 잘 당 기준 10 μL를로드합니다. 우물로 일하고 시약의 0.2 ML를로드합니다. 실링 테이프와 플레이트를 커버하고 30 초 섞어 흔들. ° C 30 분 37 접시를 품어. 595 나노미터 파장에서 플레이트 판독기에 읽기 전에 실온 (약 10 분)에 쿨 플레이트. 예상 농도 비교 측정 흡광도와 Microsoft Excel을 사용하여 표준 곡선을 구축. 좋은 상관 계수가 같거나 0.98보다 큽니다. 표준 곡선에서 얻은 선형 방정식을 사용하여 샘​​플의 단백질 농도를 계산합니다. 추가 처리를위한 준비까지 -80에서 단백질과 저장소의 동일한 양의 ° C에 용해 버퍼에 샘플을 희석. 단백질 농도는 200-900에서 μg / ML 제조 업체의 지침에 따라 다양한한다. 멀티 플렉스 분석을 수행합니다. 참고 : 다중 phosphoprotein의 assays은 하룻밤 incu 다음 1 세트 – 초기의 시간 접시의 로딩으로 완료하기 위해 총 이일 걸릴bation 단계 및 추가 인큐베이션 및 세척은 다음날 단계를 반복합니다. 우물은 매뉴얼에 워크시트에 따라 lysate있는가 포함되는지도 알아. 상온에서 균질 조직 샘플 및 키트 lysates를 해동 후 얼음에 놓으십시오. (streptavidin과 구슬 제외) 상온에 키트에 제공하는 모든 버퍼와 시약을 가져와. 멀티 플렉스 분석을 위해 구슬을 준비합니다. 빛과 보호하기 위해 알루미늄 호일과 결합된 구슬이 들어있는 커버 튜브. 5 초 얼음 계속을위한 와동 튜브. 결합 구슬에게 씻어 버퍼에 1시 50분을 희석. 각 잘 잘 당 50 μL의 총 부피 49 μL 씻어 버퍼에 결합된 구슬 1 μL를 포함해야합니다. 진공 장치를 보정합니다. 물론 당 100 μL 세척 버퍼와 접시를 씻으십시오. 2-5 초 이내에 초과 액체에서 진공 흡입을 켭니다. 버퍼의 완전한 제거는 더 이상 또는보다 짧은 2-5 초 걸린다면, 그에 따라 압력 밸브를 조정합니다. 샘플을 추가하기 전에 철저하게 접시의 바닥을 건조시킵니다. 5 초에 대한 소용돌이 희석 결합된 구슬과 지정된 우물 50 μL를 추가합니다. 즉시 진공은 종이 타월로 접시의 바닥을 필터링하고 건조. 물론 당 100 μL 세척 버퍼와 두 접시를 씻으십시오. 각 세척 후 접시의 바닥을 건조시킵니다. 소용돌이 3 초에 대한 샘플을 해동하고 지정된 우물 50 μL를 추가합니다. 이곳은 빛으로부터 보호 실온에서 300 rpm으로 흔들어 15-18 시간에 대한 판과 부화를 통해 테이프를 씰링. 100 μL 세척 버퍼와 진공 필터 초과하는 액체와 세척 접시 세 번. 각 세척 후 접시의 바닥을 건조시킵니다. 세척 버퍼에 탐지 항체 1시 25분을 희석. 각 물론 25 μL 세척 버퍼의 총 볼륨 1 μL 탐지 항체가 필요합니다. 접시에 씰링 테이프를 놓고 알루미늄 호일과 빛으로부터 보호합니다. 점차적으로 1,100 RPM에 속도를 증가, 30 초에 대한 흔들어. 실온에서 30 분 300 rpm으로 흔들어 계속합니다. 진공은 플레이트 필터 100 μL 세척 버퍼로 세 번 씻어. 각 세척 후 접시의 바닥을 건조시킵니다. 빛과 접시를 보호하는 동안 당 50 μL를 잘 추가하는 정도로 볼륨 streptavidin – PE의 1:100 희석을 준비합니다. 빛과 솔루션을 보호할 수 있습니다. 철저하게 소용돌이 잘 당 50 μL 희석 streptavidin – PE를 추가합니다. 30 1,100 rpm으로 잡고 품어 초는 300 rpm으로 10 분 뒤에. 진공 필터 초과 버퍼 해제. 물론 당 100 μL resuspension 버퍼와 함께 접시 세 번 씻으십시오. 각 세척 후에 철저하게 접시의 바닥을 건조시킵니다. 각 물론 125 μL resuspension 버퍼를 추가하고 1,100 rpm으로 30 초에 대한 흔들. 즉시 24 시간을위한 ° C 멀리 빛으로부터 4 판 또는 저장을 참조하십시오. 5. 모방과 시토킨 신호의 변조 재조합 시토킨 단백질이 (캐리어)를 SD의 변경을 모방하는 데 사용됩니다. 동결 건조된 단백질 (예, TNF – α)는 -20 ° C.에서 최대 1 년간 저장됩니다 3 개월 이내에 사용하기 전까지 0.1 % 소 혈청 알부민, aliquots과 주식 솔루션 diluting 후, 준비가되어 -20 ° C에 저장됩니다. 슬라이스 문화 모든 조작은 적어도 사흘 만에 새로 고쳐집니다. 시토킨 신호가로 입을 수 있습니다 : 계단식 약리 에이전트 신호 전통 시토킨의 사용; 수용성 리간드 길항제의 사용 [예 : 수용성 TNF 수용체 1 (같은 재조합 리간드에 대해 위에서 설명한)], 또는 진 입을 [즉, 작은 간섭 RNA (siRNA)]. 의 연결을 세포에 siRNA의 전달은 종종 문제가됩니다. 일반 지질 기반 시약은 일반적으로 낮은 transfection 효율 및 세포 생존 능력의 손실 발생. 대신, 우리는 transfection 시약을 사용하지 않고 고효율 분해를 허용 써모 사이 언티픽의 Dharmacon Accell의 siRNAs를 사용합니다. 여기 슬라이스 문화에서이 방법의 사용 확인으로 cyclophilin B, 모든 세포 유형의 표현이 아닌 필수 단백질의 분해를 보여줍니다. 배달 프로토콜은 자기편 세포에 사용하기 위해 제조 업체의 지침에서 슬라이스 문화 적응했다. RNase 무료 물로 1X로 배 siRNA 버퍼를 희석. 1X 버퍼 100μM siRNA 솔루션을 준비 Cyclophilin B의 siRNA 5 nmol에서 제공됩니다. 100 μm의 주식에 대한 1X 버퍼의 50 μL에 Resuspend. Accell 전달 mediu와 믹스 siRNA1μM siRNA의 최종 농도 해요. 6 잘 판에 Accell 전달 매체의 1,100 μL 100 μm의 주식 siRNA 11 μL를 추가합니다. 인큐베이터에있는 장소와 온도가 최소한 20 분 정상적인 배양 조건에 평형 수 있습니다. 배달 믹스 함유 우물에 BSL – 2 후드 및 무균 기술, 전송 삽입을 사용합니다. 단백질 분해를 위해 96 시간을위한 배달 믹스와 부화. 서양 얼룩에 의해 단백질 분해를 평가하거나 immunostaining을 강화. 최저 효율을위한 잠재적인 첫번째 선택하면서 서양 blots는 SD의 비 유해한 현상과 관련된 낮은 수준의 면역 신호에 너무 둔감 수 있습니다. 따라서, 우리는 실버 향상된 diaminobenzidine (DAB) immunostaining 및 컴퓨터 기반의 densitometry 측정 (아래 참조)과 함께 부정적인 서양 얼룩 측정을 따라있다. 6. Proteomic 주문 확인 phosphoprotein 변경 세포 특이성은 immunostaining를 사용하여 설정됩니다. 6,7 구성된 PLP의 정착액 24 시간을위한 슬라이스 문화를 수정 : 10 ML 16 % paraformaldehyde, 1.096 g 라이신, 0.42 g의 나트륨 인산염, 및 0.17 g의 나트륨 periodate은 ultrapure 물 (정착액은 6.2 산도 임) 80 ML의 총 볼륨으로 가득 찼다. 24 시간 후, 부드럽게 섹션 준비까지 좋은 칫솔과 PBS가 포함된 나트륨 azide (100 MG / L)로 전송로 삽입에서 슬라이스 문화를 제거합니다. 그런 다음, 조각에게 PBS – 20 %의 자당 최소 24 시간을 품어 20 μm의 섹션에 전체 슬라이스 문화를 잘라하고, 젤 코팅 슬라이드에 탑재합니다. ~ 50 rpm으로 흔들어에 결합하여 모든 단계를 다음과 같이 형광 immunostaining (예, NFκB)을 달성입니다. 10 분 3 ML PBS로 세 번 슬라이스 문화를 씻으십시오. 함께 플레이스 슬라이드를 모두 씻어 단계에 대한 ~ 40 ML PBS로 코플린의 단지 20 μm의 슬라이스 문화를 탑재. PBS 세 번, 씻어 당 10 분에 슬라이스 문화를 씻으십시오. 슬라이스 문화 SFX 신호 향상제 몇 방울을 넣고 30 분 습기 챔버에 품어. 37 2 시간에 대한 슬라이스 문화를 품어 ° 0.75 %로 희석 1:100에서 토끼 방지 NFκβ 항체와 C 트리톤 PBS에서 X – 100. 직접 조각에 피펫 항체 솔루션입니다. 항체 용액에서 조각을 제거하고 씻어 당 10 분 PBS로 세 번 씻어. PBS의 트리톤 X – 100 0.75 %에 1시 50분에서 염소 안티 – 토끼 AlexaFluor 594 항체 한 시간 동안 실온에서 조각 품어. 솔루션에서 형성 수있는 침전물을 제거하는 10,000 RPM 15 분 AlexaFluor 594 항체를 원심 분리기. PBS, 세차 당 10 분 안에 세 번 씻으십시오. 증류수에 수영 슬라이드 PBS로부터 염분을 씻어 수 있습니다. 함께 Coverslip는 antifade 미디어를 연장하고 빛으로부터 멀리 커버, 적어도 2 시간 건조하게. 전통 또는 공촛점 (그림 7) 형광 현미경과 시각화. siRNA의 최저에서 단백질 생산 변경 sensitively 실버 강하게 함 16 이후 densitometric 부량 (예 : 같은 cyclophilin B를 보시려면 여기를 참조) (비디오 그림 2)을 통해 7 immunostaining 전통 DAB를 강화하여 평가하실 수 있습니다. cyclophilin B에 대한 Immunostaining하면 사용 명시야 영상 7, 우리는 최근 세부에 대한 표준 절차를 다음과 24 시간 동안 안티 – 마우스 cyclophilin B (1:100) 4 ° C; 양고추냉이 퍼옥시데이즈 차 항체 라벨 (1:100)에 의해 다음; 그리고 DAB의 시각화. DAB 반응 디지털 densitometric quantification17 수 있도록 너무 희미 F, 그들은 퀸과 Graybiel에 따라 차별화된 실버 절차 강화 수 있습니다. 16 슬라이드 Rehydrate하고 철저하게 고순도 물 속에 10 분 동안 X 3 씻으십시오. 코플린 병 56 ° C.에 따뜻한에서 고순도 물에 넣어 슬라이드 ammoniacal 실버 질산 용액 (0.5 %)를 준비 : 주식 암모늄 염화물 (25~30%)는 신선한 고순도 물 (1:1) 희석 수 있습니다. 암모늄 수산화물 (100 ML 당 ~ 500-600 μL) 간략 흐린 후 맑은 바뀝니다 0.5 % 실버 질산 용액에 교반과 드롭 들러를 추가합니다. 56에 대한 해결책을 따뜻한 ° C. 10-12 분 섹션을 품어. 고순도 물 (이것과 이후의 모든 단계가 코플린의 단지를 사용하여 실온에서 완료) 15 초에 대한 슬라이드를 씻으십시오. 딥 1 % 나트륨 thiosulfate (pentahydrate) 15 초에 대한 슬라이드. 딥는 고순도 물에서 15 초에 대한 슬라이드. 0.2 % 골드 염화 2 분 톤 슬라이드를. 15 초위한 고순도 물 슬라이드를 찍어. 2 분 0.5 % 괭이밥에서 채취한 산성에 슬라이드를 쉽게받을 수 있습니다. 고순도 물에서 15 초에 대한 슬라이드를 찍어. 5 % 나트륨 thiosulfate 5 분 슬라이드를 처리합니다. 워시는 고순도 물, 탈수 및 coverslip에 철저히 슬라이드. 슬라이드 지금 densitometric 부량에 대한 준비가되어 있습니다. 17 명시야 조명 포함한 모든 장비, 영상 이전에 적어도 20 분 동안 켜집니다. 전체 슬라이스 문화 섹션은 거꾸로 현미경에 5 10X에서 몇 군데 있습니다. 광 강도가 일정한 수준 (예 : ~ 2.6 V)로 설정하고 모든 이미지 인수를 통해 변경되지 않습니다. 중립 밀도 필터로 "0"완전히 검은색이며, 4095은 완전히 흰색 12 비트 크기 (0-4095)에 ~ 1500 빛의 강도를 전송 전체 이미지를 줄이기 위해 필요한 데 사용됩니다. 디지털 이미지는 다음 인수와 슬라이스 문화 섹션없이 슬라이드의 영역을 형성 파생 배경 이미지를 포함한 모든 (즉, 가짜 제어 및 실험 샘플)에 대한 전자 저장됩니다. 배경 이미지는 모든 이미지 (사기 및 실험) 및 각 슬라이스 문화 주위에 그려 및 등록 빛의 강도를 전송 관심 영역 (AOI)에서 빼서입니다. 이미지 강도 범위는 모든 실험에 대해 일정한 범위로 설정됩니다. 지혜로움에 대해, 결과는 제어 수준 (그림 8)에 비해 상대 밀도로 표시됩니다. 7. 대표 결과 : 그림 1. 슬라이스 문화 electrophysiological 녹음 패러다임. 녹화 microelectrode 먼저 CA3 피라미드 신경 세포 계층에 배치됩니다 다음 바이폴라 자극 전극은 이가있는 이랑 (DG)에 배치됩니다. 그림 2. CA3 현장 잠재력을 evoked하고 synaptically 우울증 확산 유도. (A) 실험 표준 CA3 지역 현장 잠재 반응 후 반 최대한의 강도가 CA3 지역 evoked 필드 잠재력을 이끌어내는 데 사용되는을 극대화하기 위해 필요한 전류의 결정과 함께 시작합니다. 이것은 준비 사이 evoked 시냅스 반응의 정상을 설명합니다. 슬라이스 필드 흥분성의 게시물 시냅스 후보가 적어도 3 MV하지 않은 경우 슬라이스가 삭제됩니다. 확산 우울증 실행을위한 (B) 다음 횡단 synaptically evoked 임계값은 같은 시간 필드 잠재력에서 동안 (왼쪽 (오른쪽, 느린 응답) 결정됩니다 , 빠른 응답)은 준비가 10 Hz에서 자극 (예, 빠른 잠재 기록에 수직 편차의 amplitudes가 비슷한)에 따라 충분한 건강되는 문서에 사용됩니다. 그림 3. 감소 시냅스 활동. 증거와 관련된 Microglial 움직임은 microglial 지점은 확장 및 증가 시냅스 활동과 함께 철회 것을 보여줍니다하지만, 시냅스 활동에 대한 응답에서 이러한 세포의 장거리 움직임은 손상되지 않은 머리에 설명되지 않았습니다. 이러한 세포의 일부가 정상적인 조건에서 장거리를 이동할 것을 microglia 쇼 형광 isolectin B4 라벨을 사용하여 Google 검색 결과. 함께 이미지와 같이 시냅스 활동이 테트로도톡신에 문화에 노출에 의해 폐지 때 또한, 이러한 여행 microglia의 숫자가 크게 증가합니다. 레드 라인 마크 경로는 몇 가지 모범 microglia의 출처를 표시 파란색 화살표가있는 6 시간의 기간 동안 microglia의 여행. 보정 바, 50 μm의. 그림 4. PCR 검사 활동. . 혼자 Qiagen 키트의 사용보다 hippocampal 슬라이스 문화에서 RNA 수율 (B)에서, (A) 우리는 우리의 손에, 크게 더이 결과 (T – 테스트 P <0.001), 이후 RNA 분리에 대한 Qiagen 키트와 함께 TRIzol를 사용하여 또한, 우리는 정기적으로 날카로운 RNA 밴드를 보여줍니다 젤을 통해 결정된 우리의 RNA 추출 절차는 고품질 그대로 RNA를 생성되었는지 확인합니다. (C) 우리는 최고의 안정성 값을 참조 유전자를 선택하는 NormFinder 소프트웨어를 사용합니다. 예를 들어, 슬라이스 문화 노출lipopolyssacharide (2 시간 100 NG / ML) 세 가지 참조 유전자 (Rpl13a, β – 굴지, 18 기의)를 분석했다. CT 값 안정 값을 계산하는 데 사용됩니다. 여기서 우리의 데이터를 [그 확산 우울증 (데이터가 표시되지 않음) 사용하여 다른 실험] Rpl13a가 최적 참조 유전자는 것을 보여주고 있습니다. (D) 우리는 실험 그룹과 가짜 컨트롤 사이의 접이식 변경 RNA의 차이를 검출 민감하고 재현할 방법으로 "ΔΔCt"메서드를 사용합니다. 그림 5. PCR 반응 확인합니다. (A) 우리는 PCR 반응의 품질을 확인하는 수단으로 primers에 대한 희석 곡선 amplifications를 측정합니다. 예를 들어, 최적의 amplifications는 CT의 임계값에 균일 (1-5) 증가를 보여줍니다. (B) 반면, amplifications는 가난한 primers (1-5)로 균일하지 않습니다. (C) 또한, 우리가에 용해 곡선을 수행 원하는 amplicons가 DNA와 misannealed PCR 제품을 (여러 피크 곡선으로 나타납니다)을 오염, 뇌관의 dimers 포함하여 이중 좌초된 DNA의 부재를 나타내는, (즉, 하나의 피크 곡선)을 감지하고 있는지 확인 PCR의 assays의 결론. 그림 6. 나노 사전 증폭은 hippocampal 슬라이스 문화에 IFN – λ의 검색이 가능합니다.에만부터 ~ 50 T – 세포가 슬라이스 문화 (아웃 ~ 55,000-90,000 총 세포)에서 찾을 수 있으며, 우리가 같이 알티 2 나노 PreAMP cDNA 합성 키트를 사용하여 는 IFN – λ의 잠재적인 초저 수준의 표현을 감지하는 것을 의미합니다. cDNA preamplification의이 방법은 레벨을 RNA에 감도에 12 배 증가를 제공했습니다. 위에 표시된 결과는 검출 감도를 높이기 위해 preamplification의 용량을 보여줍니다. 참조 유전자 Rpl13a에 대한 CT 임계값 초기 증폭과 20.5되었고 이것은 preamplification 키트, cDNA의 PCR 증폭 12주기에 해당하는 12 배 증가의 사용과 14.1로 증가했다. 병렬, IFN – λ가 감지 아니었 (0.0)하지만 preamplification로 감지 범위 (29.0) 내에서 잘했습니다. 그림 7. 타고난 시토킨 경로의 phosphoprotein의 인산화 변경됩니다. hippocampal 슬라이스 문화에 excitotoxic 부상 후 타고난 시토킨 경로의 phosphoprotein의 인산화 24 시간에 (A) TNF – α의 간접 효과는 전처리 (즉, neuroprotection). 결과는 NMDA 혼자 (즉, 실험 대 사기)에 노출 사람에 비해 N – 메틸 – D – aspartate (NMDA)에 노출되기 전에 100 NG / ML TNF – α와 함께 3 일간 pretreated 조각 사이의 CA1 지역의 변화를 표시하는 것은으로 표현 비율입니다. TNF – α는 JNK 및 ATF – 2의 지속적인 인산화 증가뿐만 아니라 NFκB에 과도 증가 유도된 것을 확인할 수 있습니다. (B) NFκB 활성화 (즉, 핵에 phosphorylated NFκB의 존재)의 공간적 분포는 (immunostaining에 의해 드러났습니다 빨간색). [astrocytes의 예 (화살표 머리)] 슬라이스 문화 섹션에서 유유의 얼룩의 핵 그린. 그렇지 않으면 또 녹색 나타납니다 피라미드 뉴런은, 때문에 phosphorylated NFκB (적색)로 표시 수반하는 대신 노란색입니다. 보정 바, 25 μm의. 그림 8. . 삼일 200, 500 신청 이후 글로벌 hippocampal 슬라이스 cyclophilin B 표현을 줄이고, siRNA 효율 Proteomic 확인 cyclophilin B에 대한 퍼옥시데이즈 – diaminobenzidine 기반 immunostaining의 차별화된 실버 강하게 함는 siRNA가 크게 (ANOVA – 홀름 – Sidak 방법 P <0.001) 수 보여줍니다 , 또는 1,000 NM의 siRNA.