在阿尔茨海默氏症小鼠模型神经炎斑检测

1。老鼠大脑中的固定和cryosectioning 使用二氧化碳气体，斩首和大脑中提取的转基因小鼠牺牲。 大脑是纵向中心解剖。大脑的一半将用于生化分析的干冰冰冻闪光。其他的将被淹没在4％多聚甲醛（PFA）至少48小时在4 ° C。 后至少48小时在4％PFA固定，半脑是直接传送到30％的蔗糖溶液，置于4 ° C。在点，半脑应漂浮在蔗糖溶液。当半脑沉到了谷底，通常需要大约48小时，它准备在OCT包埋cryosectioning。 cryosectioning之前，安装在旋钮华侨城的一个薄薄的一层，并允许在-20 ° C冻结小脑上一层冰冻华侨城删除从半侧大脑和地方休息。立即盖华侨城半侧大脑，让慢慢冻结在-20 ° C。一旦华侨城嵌入大脑已经变成了不透明的，它是准备切片。 设置每节30微米的厚度。 D' Olomos解决方案的容器收集到每个切片。 2。免疫组织化学过程神经炎斑（自由浮动部分） 对待每节15分钟，在88％甲酸。甲酸处理后，将暂时关闭部分不透明，并且可能会出现萎缩。 取出到一个盘子和凭借TX – PBS（0.3％的Triton X – 100的PBS）洗5分钟× 3，轻轻摇动中的每个部分。 阻断内源性过氧化物阻断0.5％H 2 O 2在Tx – PBS中，RT，轻轻摇动30分钟。 洗10分钟× 3节的Tx – PBS，轻轻摇动。 块段与非脂肪5％脱脂牛奶的Tx – PBS在室温下溶解，轻轻摇动1小时。 孵育部分初级抗体（生物素4G8，1:500-1:2000，徽记）的Tx – PBS在4 5％的牛奶含有稀释° C轻轻摇动过夜。 洗10分钟× 3节的Tx – PBS，轻轻摇动。 准备ABC的解决方案制造商的协议（精英实验室，美国广播公司（ABC），矢量）。在ABC混合物孵育30分钟，轻轻摇动部分。 洗10分钟× 3节的Tx – PBS，轻轻摇动。 准备3,3' – 二氨基tetrahydrochloride（民建联）（矢量实验室）以下制造商的协议。在民建联的混合物为5-10分钟孵育部分。在这一点上，你会发现一个棕褐色的每一节。 洗10分钟× 3节的Tx – PBS，轻轻摇动。 明胶涂层片安装在自由浮动的脑切片，以帮助组织粘连。部分，然后通过一系列二甲苯结算和风干之后安装在Entellen。 斑块40X放大倍率的光学显微镜下观察，并通过量化评估每个鼠标的计数每片平均斑块。 3。 Thioflavin S染色神经炎斑块的检测程序鼠标牺牲和脑提取过程是在第1.1至1.5表示。 山半到4至5玻片脑切片和允许完全风干染色前。 用70％乙醇1分钟的幻灯片。 用80％乙醇1分钟的幻灯片。 过滤（0.2微米的过滤器）thioflavin小号溶液（1％）80％的乙醇中孵育15分钟的幻灯片。 （Thioflavin s解决方案需要在每次使用前过滤）。注：保护光thioflavin S和避光染色的幻灯片。 用80％乙醇1分钟的幻灯片。 用70％乙醇1分钟的幻灯片。 用蒸馏水洗两次。 山在水溶液中的安装媒体，并允许幻灯片干燥至少2小时，用透明指甲油密封盖玻片，在黑暗中的幻灯片。染色切片，应存放在黑暗中，在4 ° C。 绿色荧光染色斑块可与荧光microscropy可视化。分析一个星期内的幻灯片，因为随着时间的推移会褪色染色。 4。代表性的成果在我们最近的抗癫痫药物的疗效和情绪稳定剂丙戊酸（VPA），以抑制神经炎斑块的形成研究中，我们使用上面介绍的免疫和thioflavin S染色程序，以确定在AD模型小鼠（3）神经炎斑。图1展示了一个典型的9个月大的APP23转基因小鼠，通过与抗生物素化的Aβ使用4G8和染色ABC法检测。神经炎斑是清楚的标记抗体，是由白色箭头表示。使用thioflavin S染色，我们发现2个月大的APP23xPS TRA神经炎斑块沉积nsgenic小鼠（图2）。 Thioflavin小号约束Aβ含神经炎斑出现绿色荧光显微镜下（白色箭头表示）。我们发现，丙戊酸钠治疗，神经炎斑块的形成明显减少（3）。在另一项研究中，我们研究的分子联系，底层缺氧和AD的发病机制。同样，使用都4G8抗Aβ的免疫组织化学染色和thioflavin S染色，我们发现，缺氧，促进形成含有神经炎斑的Aβ（4）。 图1。神经炎斑块的形成在AD转基因小鼠的免疫组织化学分析。APP23在9个月的年龄处死，并进行了解剖，固定和切片。在海马神经炎斑检测使用一种抗Aβ抗体4G8和使用ABC和DAB方法进行开发。 40X光镜与斑块。白色箭头指向的Aβ神经炎斑。 图2。 Thioflavin S染色在公元建模小鼠神经炎斑。APP23xPS45双转基因小鼠，8周龄处死，并进行了解剖，固定，并切片。在海马神经炎瘟疫被证实使用thioflavin小号荧光染色，在显微镜下可视化40X放大倍率。白色箭头指示thioflavin小号染色神经炎斑。