La détection de plaques séniles dans le modèle d'Alzheimer La maladie de la souris

1. Fixation des cerveaux de souris et de cryosectioning Les souris transgéniques sont sacrifiés à l'aide de gaz de dioxyde de carbone, suivie par la décapitation et le cerveau extrait. Le cerveau est disséqué longitudinalement au centre. La moitié du cerveau seront surgelés sur glace sèche pour l'analyse biochimique. L'autre sera submergé dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) pour au moins 48 heures à 4 ° C. Après fixation au PFA 4% pendant au moins 48 heures, le cerveau hémi est transféré directement dans la solution de saccharose à 30% et placés à 4 ° C. Au point, le cerveau hémi doit être flottant dans la solution de saccharose. Quand le cerveau hémi coulé au fond, nécessitant habituellement environ 48 heures, il est prêt à être incorporé dans PTOM pour cryosectioning. Avant cryosectioning, monter une fine couche de PTOM sur le bouton et laisser congeler à -20 ° C. Retirez le cervelet du reste du cerveau hémi et placer sur la couche de gelée octobre Recouvrir immédiatement le cerveau avec des hémi PTOM et permettent une lente congeler à -20 ° C. Une fois l'enrobage PTOM Le cerveau a tourné opaque, il est prêt à être sectionné. Définissez l'épaisseur de chaque section à 30 um. Recueillir chaque tranche dans un récipient avec D'Olomos solution. 2. Procédure d'immunohistochimie pour plaques séniles (gratuit sections flottantes) Traiter chaque section dans l'acide formique à 88% pendant 15 minutes. Après traitement à l'acide formique, la section sera temporairement tournera opaque et peut apparaître à se ratatiner. Retirez chaque section dans une plaque et laver avec Tx-PBS (0,3% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 5 min x 3 avec agitation douce. Peroxyde bloc endogène bloquant 0,5% H 2 O 2 en Tx-PBS, RT 30 min en remuant doucement. Lavez section avec Tx-PBS pendant 10 min x 3 avec agitation douce. La section de bloc avec 5% non gras du lait écrémé dissous dans Tx-PBS à température ambiante pendant 1 heure en agitant doucement. Incuber sections dans l'anticorps primaire (biotinylé 4G8, 1:500-1:2000, Sceau) dilué dans Tx-PBS contenant 5% de lait à 4 ° C pendant une nuit sous agitation douce. Lavez section avec Tx-PBS pendant 10 min x 3 avec agitation douce. Préparer le protocole du fabricant ABC solution suivante (Elite ABC, Vector Laboratories,). Incuber sections dans le mélange de ABC pendant 30 min en remuant doucement. Lavez section avec Tx-PBS pendant 10 min x 3 avec agitation douce. Préparer 3,3 '-diaminobenzidine tétrachlorhydrate (DAB) (Vector Laboratories) le protocole du fabricant. Incuber le mélange de sections DAB pendant 5-10 min. À ce stade, vous pourrez observer une couleur brunâtre se développer sur chaque section. Lavez section avec Tx-PBS pendant 10 min x 3 avec agitation douce. Coupes de cerveau flottant sont montées sur des lames recouvertes de gélatine, pour aider à l'adhérence des tissus. Les articles sont ensuite séchés à l'air suivie par compensation avec une série de xylène et monté dans Entellen. Les plaques sont visualisés en microscopie optique à un grossissement de 40X et sont quantifiés en évaluant le nombre de plaques signifie par tranche pour chaque souris. 3. Thioflavine S coloration procédure de détection de plaques séniles Le sacrifice de la souris et la procédure d'extraction du cerveau sont, comme indiqué dans les sections 1.1 à 1.5. Mont 4 à 5 coupes de cerveau hémi sur une lame de verre et laisser sécher à l'air complètement avant la coloration. Laver les lames à l'éthanol 70% pendant 1 minute. Laver les lames avec de l'éthanol 80% pendant 1 minute. Incuber les lames dans la solution filtrée (filtre de 0,2 um) thioflavine S (1% dans 80% d'éthanol) pendant 15 minutes. (Solution thioflavine S doit être filtrée avant chaque utilisation). Remarque: protéger la thioflavine S de la lumière et à protéger les lames colorées de la lumière. Laver les lames avec de l'éthanol 80% pendant 1 minute. Laver les lames avec de l'éthanol 1 minute à 70%. Laver à l'eau distillée deux fois. Mont diapositives en milieu aqueux de montage et permettent lames sécher dans l'obscurité pendant au moins 2 heures, suivie par la lamelle d'étanchéité avec du vernis à ongles transparent. Les sections colorées doivent être stockés dans l'obscurité à 4 ° C. La fluorescence verte plaques colorées pourrait être visualisées avec microscropy fluorescentes. Analyser des diapositives dans une semaine à cause de la coloration va s'estomper avec le temps. 4. Les résultats représentatifs Dans notre étude récente sur l'efficacité du médicament anti-épileptique et l'acide stabilisateur de l'humeur valproïque (VPA) à inhiber la formation de plaques séniles, nous avons utilisé l'immunomarquage ci-dessus décrites et thioflavine S coloration des procédures pour identifier les plaques séniles chez la souris modèle AD (3). La figure 1 représente une caractéristique de 9 mois APP23 souris transgénique, teinté d'anti-Aß utilisant 4G8 biotinylé et détectée par la méthode ABC. Plaques séniles sont clairement marquées avec l'anticorps et sont indiqués par des flèches blanches. Utilisant une coloration thioflavine S, nous avons détecté dépôt de plaque neuritique 2 mois APP23xPS TRAnsgenic souris (figure 2). Thioflavine S liée plaques séniles contenant Aßi apparaît sous microscopie à fluorescence verte (indiquées par des flèches blanches). Nous avons montré que le traitement APV, la formation de plaques séniles est significativement réduite (3). Dans une autre étude, nous avons étudié l'hypoxie lien moléculaire sous-jacente et la pathogenèse AD. Encore une fois, en utilisant à la fois coloration immunohistochimique 4G8 anti-Aß et coloration thioflavine S, nous avons constaté que l'hypoxie a facilité la formation de plaques séniles contenant Aß (4). Figure 1. L'analyse immunohistochimique de formation de plaques séniles chez des souris transgéniques après JC. APP23 souris à l'âge de 9 mois ont été sacrifiés et ont été disséqués, fixe, et sectionné. Plaques séniles dans le hippocampe ont été détectés en utilisant un anticorps anti-4G8 Aßi et ont été développés en utilisant les méthodes ABC et DAB. Les plaques ont été visualisées par microscopie optique en 40X. Les flèches blanches au point de plaques séniles Aß. Figure 2. Coloration thioflavine S de plaques séniles chez les souris AD modélisés. APP23xPS45 souris doublement transgéniques à 8 semaines ont été sacrifiés et ont été disséqués, fixe, et sectionné. Fléaux neuritique dans l'hippocampe sont ont été confirmés en utilisant coloration fluorescente thioflavine S et visualisées par microscopie à un grossissement de 40X. Les flèches blanches indiquent les plaques séniles thioflavine S tachés.