Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

1. Dissecção dos fêmures e tíbias de rato e cultura de células da medula óssea Sacrifício 2 camundongos por asfixia CO 2 e dissecar cuidadosamente tíbias e fêmures sem cortar as extremidades dos ossos. Limpa os ossos de todos os tecidos anexado usando lenço de papel. Tenha cuidado para não quebrar os ossos. Esterilizar os ossos por imersão em etanol 70% por 10 min em uma placa de Petri 35 mm. A partir deste momento, o trabalho dentro de uma capa de biossegurança para evitar a contaminação das culturas de células. Recuperar os ossos a partir do etanol e deixe-os secar por 5 min em uma placa de Petri dentro do armário de biossegurança. Cortar os fêmures no meio, e da tíbia por sua ponta mais fina. Infundir o interior do osso com 1 ml de meio RPMI (sem soro, mas com antibióticos), utilizando uma seringa estéril sobre uma placa de Petri estéril. A suspensão de células são coletadas e lavadas em meio RPMI 2X por 10 min de centrifugação em um tubo de centrífuga de 15 ml a 1.100 RPM em uma centrífuga refrigerada (4 ° C) com um rotor de caçamba móvel. Após a última lavagem, ressuspender as células em 2 ml de tampão de lise ACK e incubar por 5 min à temperatura ambiente, a fim de eliminar as células vermelhas do sangue. Adicionar 13 ml de RPMI com 10% de FBS, ressuspender e lavar 2X neste meio com as mesmas configurações, conforme descrito em 1.6. Contagem de células, ajustar a 2 x 10 5 células / ml com RPMI 10% FBS, e adicionar rm-GM-CSF (20 concentração ng / ml final) 5. Adicionar 10 ml dessa suspensão para uma qualidade microbiológica estéril, 10 cm placa de Petri, e cultura em uma incubadora de CO 2 (37 ° C CO, 5% 2). Três dias depois, adicionar outra de 10 ml de RPMI 10% FBS com 20 ng / l de rmGM-CSF a cada um dos pratos preparados. Três dias depois, 10 ml de suspensão de células são recuperados a partir de cada placa de Petri, centrifugados como em 1.6, ressuspendido em igual volume de RPMI com 10% FBS rmGM-CSF e voltou para a placa de Petri. As células são cultivadas por 2 dias adicionais no 2 CO incubadora. 2. Coleta e rotulagem das DCs Depois de 8 dias em cultura de células frouxamente aderente são recuperados pela lavagem das placas de Petri com meio fresco. Este protocolo torna em torno de 2-4 x10 8 DCs em nossas mãos. As células podem ser analisados ​​para DC fenótipo por citometria de fluxo. Células coletadas são então rotulados com o Qtracker Labeling Kit 655 celular seguindo estritamente as instruções do fabricante. Temos excelentes resultados rotulagem derivadas da medula óssea de camundongos DCs com Qdots em uma concentração 10 nM. Para conseguir isso, alíquotas de Qtracker Celular componentes Kit Labeling A e B são misturados em volumes iguais, incubadas por 5 min à temperatura ambiente, e imediatamente diluído 1 / 100 em meio fresco com vórtex por 30 s. Para manchar 5 x 10 6 DCs, mistura de 5 mL de cada componentes do kit A e B em um tubo eppendorf e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicionar 1 ml de RPMI incubar FBS 10%, e vortex por 30 segundos. Adicionar 0,5 ml de suspensão de células contendo 5 6 x10 DCs, e incubar a 37 ° C por 60 min. Então, lave as células em RPMI 2X 10% FBS (1.100 RPM). As células podem ser ressuspendido em RPMI para cultura, nem em PBS para injeção em camundongos experimental. 3. Avaliação do DC rotulados Rotulagem célula pode ser avaliada por meio de microscopia de fluorescência. Para conseguir isso, uma gota de suspensão de células é adicionado a uma lâmina de microscópio, coberto com uma lamela de vidro, e avaliada com um microscópio fluorescente tendo em conta que estes têm Qdots de emissão e excitação espectros de 565NM e 405-525nm, respectivamente (Fig. 3 ) Neste ponto, as células rotuladas podem ser usadas para injetar animais, ou de maturação pode ser induzida pela incubação destas células por 48 h (37 ° C, 5 CO 2) na presença de LPS (100 ng / ml) e TNF-( 20 ng / ml). Fluorescentes de rotulagem não é afetado por DC maturação (Fig. 4). 4. Resultados representativos: Com isto, descrito como preparar derivadas da medula óssea de camundongos DCs e como rotulou-os com Qdots fluorescente. Fig. 1 resume o procedimento para obter as células, enquanto a fig. 2 mostra o procedimento para classificá-los com Qdots. Como mostrado na figura. 3, quase todas as células são rotulados por este procedimento, e este não é afetada pela DC maturação com fatores inflamatórios (Fig. 4). Fig. 5 mostra que Qdot manchada de DCs (Fig.5a) comportam-se semelhante a células não-manchada quando tratados com um cocktail inflamatórias. Ambas as preparações de células de forma semelhante upregulate expressão de moléculas co-estimulatórias (Fig. 5b) e produzir quantidades semelhantes de IL-6 (Fig. 5c) e óxido nítrico (Fig. 5d) sobre os estímulos de maturação. Isto concorda com a PREVIous dados publicados, indicando que a coloração Qdot não afeta a capacidade de DC para se transformar em células maduras capazes de induzir respostas imunes [6]. Estas células podem ser usadas para injetar animais experimentais. Como mostrado na figura. 6, dois dias após a injeção intravenosa de DCs rotulados em camundongos, que foram capazes de detectar Qdot manchada de células do baço. Este também é de acordo com dados publicados previamente mostrando o uso de nanocristais Qdot para avaliar a migração de DC in vivo [6], não-invasivo de imagens e citometria de fluxo. Figura Fluxograma 1. DC de geração a partir de medula óssea. Com isto, descrevem o processo para obter derivadas da medula óssea DC. Ambas as tíbias e fêmures são dissecados e limpa do tecido circundante. Dicas óssea são preservadas e do interior dos ossos são lavados com meio. Depois de eliminar os glóbulos vermelhos, células da medula óssea são cultivados por 8 dias na presença de GM-CSF para diferenciá-los em DCs. Figura Fluxograma 2. Do procedimento de rotulagem. Alíquotas iguais de Qtracker Celular componentes Kit Labeling A e B são misturados em um tubo eppendorf. As células dendríticas são recolhidos a partir de 8 dias culturas de medula óssea com a GM-CSF e misturado com o corante de rotulagem para os 60 minutos a 37C. Em seguida, as células são lavadas na mídia para eliminar as partículas rotulagem excesso. Figura 3. Microfotografia fluorescente de DCs imediatamente após rotulagem. Uma gota de células marcadas foi depositado em uma lâmina de vidro e coberto por uma lamínula. Então, as amostras foram avaliadas em um microscópio de fluorescência e as imagens foram adquiridas através de uma câmera digital 5,0 Micropublisher Cor CCD (Qimaging, Surrey, BC Canada). Figura 4. Microfotografia fluorescente de DCs após 48 h de maturação in vitro. DCs rotulados foram cultivadas por 48 h com LPS (100 ng / ml) e TNF-α (20 ng / ml) em lâminas de vidro em uma incubadora de CO 2 (37 ° C CO, 5% 2). Então, as amostras foram lavadas com PBS (5 min, 2X), fixado com acetona (15 min, 4 ° C) e contrastado com DAPI. As células foram avaliadas em um microscópio de fluorescência como acima. Figura 5. A atividade biológica de Qdot manchada DCs maduras. DCs rotulados maturados in vitro como acima foram analisados ​​por citometria de fluxo (A) e (B). (A) Qdot manchada de células dão um sinal forte no canal FL3 (PerCP). Sombreada histograma: controle imaculada. (B) DCs Qdot manchadas e sem manchas foram adicionalmente corados com anticorpos específicos contra maturação marcadores CD86 e CD40; e controles isotipo. As células foram então analisados ​​em um citômetro de fluxo FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA). Além disso, IL-6 (C) e óxido nítrico (NO) foram determinados em sobrenadantes de madura Qdot manchada de DCs e controles. Níveis de IL-6 e óxido nítrico foi determinada por meio de ELISA análise e ensaio de Griess como temos descrito anteriormente 7, 8. Todos os dados mostraram nesta figura é representativa de dois ou três experimentos independentes mostrando resultados semelhantes. Os dados foram analisados ​​por ANOVA, utilizando o software GraphPad. Figura 6. Detecção de DCs rotuladas de tecidos dissecados. Rotulados DCs maduras (1×10 6 células) foram injetadas em ratos por via intravenosa C57BL / 6. (A) Dois dias depois, os ratos foram sacrificados e os baços coletados, snap congelados, embutidos em outubro e 8 seções mM preparada com a criostato. Em seguida, amostras foram fixadas com acetona (15 min, 4 ° C) e contrastado com DAPI. As células foram avaliadas em um microscópio de fluorescência como acima Fig. 6a:. Ampliação de 40x, Fig. 6b: aumento de 100X, fig. Ampliação, 6C 400X.