Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Выбор подходящего штамма дрожжей контроль Анализ основан на оценке экспериментатором визуально накопления красной флуоресценции в дрожжах вакуоли. Как такой анализ является субъективным и зависит от выбора подходящих штаммов контроля и условий роста. Дикий тип управления используется для обозначения уровней аутофагии обычно ожидается. В качестве отрицательного контроля напряжение нулевой для выражения одной из основных аутофагии генов (например, ATG3) подходит, такие штаммы не может доставить материал (например, митохондрий, ядра) в вакуоль 1. Преобразование дрожжевых клеток с ДНК плазмиды Дрожжевые клетки могут быть легко сделаны компетентным для преобразования обработкой LiAcetate. Коммерческие наборы могут быть приобретены (например, EasyComp, Invitrogen) и опубликованы протоколы доступны 13. В этом протоколе мы используем штаммом дикого типа BY4741 (MAT his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), и некоторые члены обширную библиотеку удаления мутантных штаммов (например, Δ atg3) производные от него, каждый хватает экспрессии различных несущественных гена. Библиотека удаления штамм представляет собой ценный инструмент для исследования аутофагии использованием Розелла основе зондов. Репортер, занятых в данный протокол MT-Розелла для митохондрий (рис. 2), кодируется pAS1NB: MT-Розелла 12. Следующие шаги основаны на использование клеток сделаны компетентным использованием Kit EasyComp Трансформация и хранят в замороженном виде при температуре -80 ° С для удобного использования. Равновесия Solution III (EasyComp Преобразование Kit) при комнатной температуре 30 минут перед добавлением дрожжевых клеток. Добавить 2-2,5 мкл (~ 100 нг / мкл) плазмидной ДНК, кодирующей репортера (pAS1NB: MT-Розелла) до 1,7 мл стерильного оснастки колпачок трубки микроцентрифужных пластика. Добавьте 5 мкл свежей талой приостановлении компетентных клеток дрожжей и перемешать, осторожно пипеткой. Добавить 50 мкл раствора III (EasyComp Преобразование Kit) и вихревые перемешать. 1,5) Инкубируйте трансформация реакции в течение 1 часа при 28-30 ° С с сильным перемешиванием каждые 15 минут с помощью вихрь миксером или вручную, щелкая трубка с палец. Тщательно передачи преобразования смеси одного YMM пластины роста агаре с гистидина, метионина и урацил и аккуратно распределяют клетки по поверхности агара стерильным разбрасыватель стекла. Дрожжевые клетки являются хрупкими, на данном этапе и бережное обращение может увеличить выход трансформантов. Инкубируйте роста пластины от 2 до 4 дней при температуре 28-30 ° С или до колонии появляются примерно 2-3 мм в диаметре. 2. Подтверждение выражение Розелла в клетках дрожжей Прежде чем приступать к детальные эксперименты правильной локализации и эффективное выражение Розелла должна быть подтверждена. Использование стерильных зубочистки выбрать для каждого штамма 5 одноместных колоний от пластины трансформации и ресуспендирования клеток в 50 мкл стерильной воды в отдельные стерильные 1,7 мл оснастки колпачок трубки микроцентрифужных пластика. Место 10 мкл каждой клеточной суспензии на отдельные помечены стекла предметные стекла (76 х 26 мм) и крышка клеточной суспензии с квадратным покровное (22 х 22 мм). Сразу изучить клетки для флуоресцентной выбросов использованием флуоресцентного микроскопа (например, Olympus Fluoview FV500). Ищите крепкого зеленого и красного флуоресценции и маркировки типичный митохондриальной локализации (рис. 2В и 2С). Остальная часть каждой колонии исследованы на флуоресценцию таким образом, должны быть прививки на свежие пластины роста YMM. Инкубируйте пластин при 28-30 ° С в течение 2 дней, пока колонии около 2-3 мм в диаметре. 3. Рост клеток и индукции аутофагии Аутофагия могут быть вызваны с помощью ряда различных экспериментальных условиях, в том числе вступление в стационарной фазы, изменение источника углерода, администрация рапамицина, или азота голода. Мы обычно используют азот голода в качестве метода, чтобы побудить mitophagy. Привить одну колонию в 10 мл ростовой среды, содержащих этанол и соответствующие добавки ауксотрофных. Инкубируйте дрожжевых культур при 28-30 ° С с орбитальным встряхивания (200 оборотов в минуту) в течение примерно 48 часов. Клетки должны быть в середине журнала фазе роста. Гранул клетки дублировать 1мл образцы культуры в 1,7 мл стерильного оснастки пластиковой крышкой центрифужные пробирки путем центрифугирования при 2000 мкг в течение 2 минут при комнатной температуре. Аккуратно снимите и выбросьте супернатант, не нарушая клеточный осадок. Вымойте клетки в три раза с 1 мл стерильной дистиллированной воды ресуспендирования с последующим центрифугированием для удаления остатков мedium. После третьего мытья ресуспендирования клеток в 100 мл среды роста или азотом голода среды. Повторно прививать ресуспендировали клеток в 10 мл свежей среды, роста или 10 мл азота голода среды. Инкубируйте с орбитальным встряхивания в течение 6-12 часов, чтобы индукция mitophagy. После голодания подготовить клетки для просмотра флуоресцентной микроскопии. Примечание: Маркировка вакуоль с CMAC-Arg При первом установлении анализа полезно для подтверждения в люминесцентном микроскопе доставки Розелла в вакуоль. Хотя дрожжи вакуоль большой органелл, местонахождение часто может быть легко определен путем ссылки на проходящем свете изображения, в некоторых штаммах дрожжей и при определенных условиях роста вакуоли могут быть фрагментированы и трудно найти. Вакуоли могут быть легко помечены использованием кумарина основе красителя вакуоль, таких как CMAC-Arg (7-амино-4-chloromethylcoumarin, L-аргинин амид). Действие вакуолярной протеаз на красителя приводит к ярко-синий флуоресценции маркировки вакуоли. Синего излучения может быть легко отличить от красных и зеленых выбросов Розелла 11. Маркировка с CMAC-Arg не должны быть выполнены в обычном порядке, но рекомендуется для тех, кто не знаком с расположением и появление вакуолей в дрожжах. 4. Маркировка вакуоль с CMAC-Arg Добавить CMAC-Arg (100 мМ конечной концентрации), чтобы рост или азотно-голодали клеток до визуализации. CMAC-Arg решение может быть подготовлен заранее, но, как решение светочувствительных он должен быть защищен от воздействия света. Инкубируйте при 28-30 ° С с орбитальным встряхивания (200 оборотов в минуту) в течение 30 минут. Гранул клетки центрифугированием при 2000 мкг в течение 2 минут при комнатной температуре. Удалите супернатант. Вымойте клетки три раза стерильной дистиллированной воды ресуспендирования с последующим центрифугированием для удаления остатков среднего и избыток CMAC-Arg красителя. Горы клетки для работы с изображениями, как описано ниже. 5. Монтаж живые клетки дрожжей для конфокальной микроскопии лазерного сканирования (CLSM) Растопите 2 мг низкой температурой плавления агарозы в отдельных 1 мл аликвоты среднего роста и азотом голода среды инкубации при температуре 70 ° C. Расплавленной агарозы поддерживается на уровне 70 ° C. Аккуратно гранул клеток в 1 мл аликвоты каждой культуре клеток путем центрифугирования при 2000 мкг в течение 2 минут при комнатной температуре и отбросить супернатанты. Вымойте клетки в три раза с 1 мл стерильной дистиллированной воды ресуспендирования и центрифугирования, как в пункте 5.2. Ресуспендируют отмытых клеток в 100 мкл стерильной дистиллированной водой. Чтобы смонтировать клетки месте 20 мкл расплавленной агарозы на помечены микроскопический слайд стекла (76 х 26 мм). Сразу же месте 10 мкл суспензии клеток мыть на кровать агарозы. Обложка кровать агарозы с покровным (22 х 22 мм). Клетки распространятся по всей поверхности агарозном под покровным стеклом. Чтобы предотвратить обезвоживание и движение во время съемки покровное тщательно уплотнение края покровного с тонким слоем лака для ногтей. Когда лак полностью высохнет (10 мин) слайд готово для просмотра, флуоресценция Остерегайтесь микроскопии: лак для ногтей может привести к повреждению микроскопом целей. Клетки монтируется с помощью этой техники можно наблюдать до 1 часа после монтажа. 6. Визуализация аутофагии использованием CLSM Уровень аутофагии в популяции клеток регулярно оценивается определения количества клеток с красным вакуолярной флуоресценции до и после индукции аутофагии. В идеале прогрессирование аутофагии контролируется в выбранных точках время после индукции аутофагии (рис. 3). Это лучше всего выполняется визуализация через микроскоп бинокулярный. Важно, что правильное управление заняты (например, Δ atg3 мутант), и что микроскоп настройки остаются неизменными между наблюдения различных образцов (например, использование нейтральные фильтры, фильтр отбора). Дрожжевые клетки являются относительно небольшими требующих хороший микроскоп флуоресценции качества (например, Olympus Fluoview FV500), оснащенных возбуждение / излучение фильтры подходят для визуализации отдельных GFP и / или pHluorin (зеленая флуоресценция выбросов) (FITC фильтр) и DsRed.T3 (красный флуоресценции выбросов) (TRITC фильтр). Использование 60x объективный взгляд водой без голода дикие клетки типа, используя попеременно FITC и TRITC фильтров. Дикие клетки типа должны обладать типичными клеточное распределение митохондрий на периферии клетки, которые показывают, как красный и зеленый флуоресценции. Обратите внимание, что это распределение митохондрий зависит от pinhоле установка конфокальной микроскопии. Мы обычно используем нижние отверстия значение 125 мкм, что позволяет только митохондрии, которые должны соблюдаться как ряд точек локализованы на периферии клетки (рис. 2), так что вакуоль не закрывались 12. Если высокое значение накола (200 мкм) используется это позволяет типичный нитчатые митохондриальной сети распределенных по всей клетке (и она претерпевает изменения), которые должны соблюдаться 11. Никаких других структур в клетке должны быть помечены флуоресцентно. Последовательно зрения клетки для каждого момента времени после перевода на голодную смерть среды. Визуализируйте попеременно использованием зеленого и красного фильтров выбросов. В 6 часов голодания время флуоресценции точка красный, но нет соответствующего зеленого излучения должна быть заметной в вакуоли. Вакуолярной локализации может быть подтверждено с помощью отдельно CMAC-Arg (рис. 2). Посмотреть ~ 200 клеток и подсчета числа, которые показывают только красной флуоресценции в вакуоль (т.е. вакуолярной поглощение митохондрий). Граф вакуолярной накопления для всех временных точках наблюдения> 200 клеток, а затем участок процент клеток с вакуолярной накопления. Изучить аутофагии-отрицательного контроля клеток, экспрессирующих MT-Розелла до голода и после 6 часов голодания. 7. Представитель результаты: Здесь мы покажем типичные результаты полученные с помощью MT-Розелла, выраженное в дикого типа и Δatg3 мутантных клеток. В условиях роста с этанолом в качестве источника углерода, как дикого типа и мутантных клеток Δatg3 выставку клеточное распределение флуоресценции (красный и зеленый), характерные для митохондрий в клетках дрожжей. Красная и зеленая флуоресценция выбросов не обнаружен в вакуоли (рис. 2В и 2С). Когда подвергают азотного голодания в течение 6 ч и за его пределами, то, помимо красного и зеленого свечения соответствующей митохондриях, дикий тип клетки также обладают красное накопления, но не зеленая флуоресценция в просвет вакуоли (рис. 2, б;. Рис. 3) . Однако в Δatg3 мутантных клеток ни красной, ни зеленой флуоресценции накапливается в вакуоли просвет (рис. 2;. Рис. 3). Рисунок 1. Top, схема органелл и отсеков в дрожжевые клетки. Снизу, вакуоль ориентированных зрения дрожжевых клеток представлена ​​указывает autophagic деградации различных органелл и отсеков. Некоторые различия между различными органелл конкретных типов аутофагии (например, mitophagy, nucleophagy) включают в себя специфику (грузовые отбор) охватил содержание, различные внутриклеточные нужды и внеклеточных сигналов (например, голод, повреждение), конкретные сигналы, АТГ генов и время зависимость. Рисунок 2. (А) Схематическое изображение MT-Розелла. Митохондриальной последовательности лидер (в данном случае цитратсинтазы) используется для целевого Розелла биосенсор на митохондриях. Возбуждение и излучение максимумов для обоих красный флуоресцентный белок (DsRed.T3) и зеленый флуоресцентный белок (pHluorin) указаны. При высоком рН (рН митохондриальной ~ 8,2) биосенсор флуоресцирует красный и зеленый, однако, при низких значениях рН (рН вакуоли ~ 5,5) она флуоресцирует только красного цвета. (B) Схематическое изображение ожидаемых результатов в дикого типа и мутанта Δ atg3 клеток, экспрессирующих МТ-Розелла. (С) Фактические результаты, полученные CLSM для диких клетки типа в условиях роста и условий азотного голодания. Слева направо:. DIC (разницу в контрастности), ППП (DsRed.T3) флуоресценцию излучением, GFP (pHluorin) флуоресценцию излучением, CMAC-Arg флуоресценции и объединить изображения (D) Фактические результаты, полученные при флуоресцентной микроскопии для Datg3 мутантных клеток под растет и условиях азотного голодания. Слева направо: DIC (разницу в контрастности), ППП (DsRed.T3) флуоресценцию излучением, GFP (pHluorin) флуоресценцию излучением, CMAC-Arg флуоресценции и слияние изображения. Рисунок 3. Процент дикого типа и Δ atg3 мутантных клеток, выражая т-Розелла и выросли в атмосфере азота голода, показывая красной флуоресценции в вакуоль за время хода 48 часов. Процент клеток с накоплением красной флуоресценции в вакуоль был записан на 0, 6, 12, 24 и 48 часов после начала азотного голодания.