Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae
Summary
גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Abstract
Autophagy חשוב מחזור של רכיבים סלולריים תחת מגוון של תנאים שונים. זה ממלא תפקיד חיוני homeostatic וכן בקרת איכות מנגנון שיכול היעד סלקטיבי לבזות חומר הסלולר כולל organelles1-4. לדוגמה, פגום או מיותר המיטוכונדריה (איור 1), לא מסולק על ידי autophagy, יכול לייצג איום על הומאוסטזיס הסלולר הישרדות התא. ב השמרים, Saccharomyces cerevisiae, חסך תזונתי (למשל, רעב חנקן) או נזק יכול לקדם מחזור סלקטיבית של המיטוכונדריה על ידי autophagy בתהליך שמכונה mitophagy 5-9.
אנו מתארים גישה פשוטה מיקרוסקופ פלואורסצנטי להעריך autophagy. לשם הבהירות אנו להגביל את התיאור שלנו כאן כדי להראות עד כמה הגישה ניתן להשתמש כדי לפקח mitophagy בתאי שמרים. Assay עושה שימוש כתב ניאון, רוזלה, המהווה biosensor כפול הפליטה הכוללת חלבון יחסית-pH יציב ניאון אדום קשור חלבון ה-pH רגיש פלואורסצנטי ירוק. המבצע של הכתב הזה מסתמך על ההבדלים בין ה-pH (5.0-5.5 pH ~) vacuole ו (pH 8.2 ~) המיטוכונדריה בתאים חיים. תחת תנאי גידול, סוג התאים בר התערוכה הן פלואורסצנטי אדום וירוק מופץ מאפיין בצורה של המיטוכונדריה. פליטת הקרינה לא קשורה vacuole. כאשר נתון רעב חנקן, מצב אשר גורם mitophagy, בנוסף פלואורסצנטי אדום וירוק תיוג במיטוכונדריה, תאים התערוכה הצטברות של האדומים, אבל לא פלואורסצנטי ירוק, את לומן vacuolar חומצי המייצג את המסירה של המיטוכונדריה כדי vacuole. ניקוד תאים עם אדום, אבל vacuoles ניאון ירוק לא יכול לשמש כמדד לפעילות mitophagic בתאים 5,10-12.
Protocol
Discussion
בתמונות שהוצגו נציג איור. 2B ו – 2C ניתן לראות בבירור כי השימוש אברון ספציפי כתבים פלורסנט מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספק ראיות של לוקליזציה והפצה המיטוכונדריה / בגידול והן חנקן מורעבים התאים, ומאפשר mitophagy להיות דמיינו.
זה יש להדגיש כי שיטה זו אינה מוגבלת mitophagy הבאה. Autophagy של מרכיבים תאיים אחרים או אברונים (למשל, הריבוזומים, טיפות השומנים, peroxisomes, reticulum endoplasmic ואת הגרעין) עשוי להיות במעקב עם תיוג מתאים. פרטי לבנות את biosensor רוזלה, תרבות תנאים התא תוצאות אופייני מחזור של גרעין (nucleophagy) דווחו 11,12 הממחישות את היישום הרחב יותר של השיטה.
השימוש אברון ספציפי כתבים ניאון עבור autophagy ניטור דורש כמה שיקולים של תכנון לבנות כדי לזכור. אלה כוללים: (1) סלקציה היתוך האות המיקוד המתאים כדי להשיג אברון ספציפי מיקוד, (2) בחירה של חלבון פלואורסצנטי מתאים (ים): (3) פליטת הקרינה חזקה; (4) לתקן לוקליזציה אברון ו / או חלוקה בתוך התא. לאחר הכתב אברון ספציפי באה לידי ביטוי בהצלחה מארח את השמרים נבחר זן קבוצה שנייה של שיקולים להיות: (1) צמיחה שמרים תנאים; (2) מדגם הכנה התא; (3) הדמיה פרמטרים כמו חשוב הפרמטרים שנבחרו עבור CLSM (למשל, עוצמת הלייזר, סריקה קצב ומצב, ערך חריר, ערך הזום, מטרות שימוש או חשיפה CCD-מצלמה) נשמרות לאורך ניסוי להבטיח כי ניתן לבצע השוואות בין שליטה (תאים גדל) דגימות רעב: ( 3) אינדוקציה autophagy ומוצלחת המסירה של כתב לתוך vacuole.
בסך הכל, זו שיטה מיקרוסקופית פלורסנט קל, מהיר יחסית, ויש לו פוטנציאל היישום ההקרנה תפוקה גבוהה עבור תרופות חדישות המשפרות או לעכב autophagy, וכן גנים המווסתים או לווסת autophagy.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האוסטרלי גרנט DP0986937.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae EasyComp Transformation Kit | Invitrogen | K5050-01 |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | BD Difco | 200-0030 |
| Low melting agarose | Progen Biosciences | 200-0030 |
| Microscope slides (76 x 26 mm) | Menzel-Gläser | |
| Microscope coverslips (22 x 22 mm) | Menzel-Gläser | BB022022A1 |
| Confocal Laser Scanning Microscope Fluoview FV500 | Olympus | |
| CMAC-Arg | Moleular Probes-Invitrogen | Y-7531 |
All concentrations given are w/v, unless otherwise indicated.
Yeast minimal medium (YMM): 0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 2% glucose, 1.5% agar (only added when making solid media) and any required auxotrophic supplements (0.01%)].
Saccharomyces Salts (SS): (NH4)2S04, 0.12%; KH2PO4, 0.10%; MgC12.6H2O, 0.07%; NaC1, 0.05%; CaCl2, 0.01%; FeC13, 0.0005%.
Growth medium: SS and 2% ethanol (v/v) and appropriate auxotrophic supplements.
Nitrogen-starvation medium: 0.17% yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate (Difco), 2% ethanol (v/v).
References
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- He, C., Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell. 40, 280-293 (2010).
- Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. Monitoring mitophagy in yeast. Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).
- Yen, W. L., Klionsky, D. J. How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging. Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).
- Tolkovsky, A. M. Mitophagy. Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).
- Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. Mitophagy in yeast: actors and physiological roles. FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).
- Kanki, T., Klionsky, D. J. The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast. Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).
- Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy. Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).
- Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags. Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, 205-213 (2008).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
