कृंतक मस्तिष्क स्लाइसें से न्यूरॉन्स की Vibrodissociation Synaptic पारेषण और छवि presynaptic टर्मिनल अध्ययन करने के लिए

1. तैयारी ज्वाला सील ग्लास micropipette Microelectrode कांच का प्रयोग, एक ज्वलंत भूरी या समकक्ष micropipette डांड़ी (टिप व्यास ~ 2 सुक्ष्ममापी) पर एक मानक पैच दबाना micropipette खींच. प्लेस micropipette 200-300 सुक्ष्ममापी की एक व्यास के साथ जुड़े गेंद रूपों तक ~ 2 सेकंड के लिए एक Bunsen बर्नर से लौ में टिप. प्लेस लौ मोहरबंद है कि तेजी से पक्ष के लिए पक्ष स्फूर्त कर सकते हैं (यात्रा दूरी 100-200 सुक्ष्ममापी) एक piezoelectric bimorph, रिले, या equivalently प्रभावी उपकरण का उपयोग कर micromanipulator पर धारक पर पैच विंदुक. 2. P1-p21 चूहे या चूहे से मस्तिष्क स्लाइसें तैयारी 124 NaCl, 4.5 KCl, 1.2 2 नाह पीओ 4, 26 NaHCO 3, और 10 डी – ग्लूकोज: (मिमी में) निम्नलिखित संरचना के साथ कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF) तैयार करें . 95% ऑक्सीजन / ~ 15 मिनट के लिए 5% सीओ 2 गैस के साथ बुलबुला समाधान है, तो 2 मिमी CaCl 2 और 1 मिमी 2 MgCl जोड़ें . मस्तिष्क स्लाइसें काटना: Halothane या isoflurane साथ पशु anesthetize. जानवर सिर काटना – मस्तिष्क निकालना – वांछित अभिविन्यास (राज्याभिषेक, parasagittal, अनुप्रस्थ, आदि) में ब्लॉक मस्तिष्क के हित के क्षेत्रों को शामिल करने के लिए. प्रत्यय अवरुद्ध एक हिल मस्तिष्क aCSF में जलमग्न slicer की अवस्था में मस्तिष्क – 250-400 सुक्ष्ममापी मोटाई पर धारा मस्तिष्क – aCSF में जगह स्लाइस जाल पर "preincubation" चैम्बर कि द्रव / सभी सतहों पर गैस जोखिम के लिए अनुमति देता में carbogen साथ bubbled स्लाइस कम से कम एक घंटे के लिए इस माध्यम में संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं. 3. Vibrodissociation 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 2 MgCl, 2.5 2 CaCl, 10 पीएच के साथ डी – ग्लूकोज 7.4 करने के लिए सेट NaOH और उपयोग: एक HEPES बफर (मिमी) संरचना के नमकीन घोल के साथ 35 मिमी व्यास संस्कृति डिश भरें osmolarity ~ 300 sucrose का उपयोग mOsM करने के लिए समायोजित. संस्कृति व्यंजन निलंबन व्यंजन, मानक सेल संस्कृति बर्तन, ग्लास coverslip आवेषण के साथ संस्कृति व्यंजन या व्यंजन के साथ, उदाहरण के लिए, पाली एल Lysine लेपित मजबूत सेल पकवान नीचे का पालन करने के लिए की आवश्यकता पर निर्भर करता है हो सकता है. संस्कृति डिश में टुकड़ा प्लेस और 250 एक्स पर एक विदारक त्रिविमेक्ष के साथ कल्पना एक तुला प्लैटिनम (0.5 मिमी व्यास) तार टुकड़ा के ऊपर सतह पर रखा एक वजन के रूप में कार्य का उपयोग कर नीचे टुकड़ा पकड़ो. टुकड़ा की सतह पर वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में लौ सील micropipette की नोक स्थिति. Micromanipulator सक्रिय करने के लिए टिप laterally 10-30 हर्ट्ज पर भ्रमण ~ दूरी 100 सुक्ष्ममापी साथ कांपना,. Micromanipulator का प्रयोग, ऐसी है कि यह ~ 30 सेकंड के भीतर पूरे टुकड़ा के माध्यम से गुजरता टुकड़ा ऊतक में टिप ले जाने के गहरे. दोहराएँ इस कदम के रूप में पृथक दिया मस्तिष्क क्षेत्र से प्राप्य न्यूरॉन्स की संख्या को अधिकतम करने की जरूरत है. टुकड़ा से निकालें टिप – संदंश के साथ टुकड़ा ले और धीरे यह जबकि अभी भी समाधान में हिला – तो टुकड़ा पूरी तरह से हटाने और त्यागें. Dissociated कोशिकाओं को व्यवस्थित करने और कम से कम 10 मिनट के लिए पकवान नीचे का पालन करने की अनुमति दें. 4. Electrophysiological रिकॉर्डिंग एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर न्यूरॉन्स युक्त पकवान प्लेस और 10 x 63 x उद्देश्य के साथ कल्पना. एक चिकनी पेटेंट झिल्ली, blebbing नहीं, और एक detectable नहीं बल्कि oversized नाभिक के साथ न्यूरॉन्स के लिए देखो. यदि चरण विपरीत प्रकाशिकी का उपयोग किया जाता है, एक पीले रंग के साथ चरण उज्ज्वल न्यूरॉन्स के लिए देखो, नीले भी नहीं. कोशिकी वांछित लवण, पोषक तत्वों, रिसेप्टर antagonists युक्त समाधान के साथ Superfuse कोशिकाओं, आदि (हमारे मानक HEPES बफर उपर्युक्त खारा है (3.1 अनुभाग)), अक्सर 5 सुक्ष्ममापी 2,3-dioxo 6 नाइट्रो-1 के साथ पूरक, 2,3,4 – tetrahydrobenzo [च] quinoxaline-7-सल्फोनामाइड disodium (NBQX), और 25-100 सुक्ष्ममापी डी 2 एमिनो 5 phosphonopentanoic (AP5) एसिड ionotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स है कि तेजी से GABA के अलगाव के लिए अनुमति देता है ब्लॉक एक रिसेप्टर की मध्यस्थता 1,2 IPSCs. एक ज्वलंत भूरी या समकक्ष खींचने का उपयोग एक मानक पैच micropipette खींचो. पिपेट टिप प्रतिरोध MΩ 2-4 (लक्ष्य कक्ष आकार पर निर्भर करता है) जब एक सीएल से भरा होना चाहिए – आधारित समाधान. एक कल्पना मानक electrophysiological तकनीकों का उपयोग न्यूरॉन से एक रिकॉर्डिंग पूरे सेल स्थापित करना. सहज postsynaptic (sPSCs) धाराओं एक अंतराल मुक्त डेटा अधिग्रहण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए रिकॉर्ड. लागू 0.2-1 सुक्ष्ममापी tetrodotoxin और / या कम + 2 Ca – कोशिकी समाधान युक्त लघु postsynaptic धाराओं (mPSCs) रिकॉर्ड. समाधान और औषधीय एजेंटों सीधे कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है. हम समाधान की मुद्रा के साथ जुड़े वर्ग इत्तला दे दी ग्लास ट्यूब टयूबिंग की पार्श्व आंदोलन से जुड़े से स्थानीय superfusion का उपयोग एक stepper मोटर चालित micromanipulator पर मुहिम शुरू की. यह alloएमएस के 100s 10s में समाधान आदान – प्रदान के लिए था कोशिकी आणविक सामग्री में तेजी से परिवर्तन, रिसेप्टर agonists के आवेदन, आदि प्राप्त करने के Akaike और उनके सहयोगियों के लिए एकल presynaptic BOUTONS उत्तेजित 3,4 तकनीक विकसित की है . एक micropipette एक कल्पना bouton के पास रखा जाता है और उत्तेजना (5-10 μA के नकारात्मक उत्तेजना धाराओं, 0.1-0.2 एमएस अवधि) दिया जाता है. एकात्मक IPSCs दर्ज कर रहे हैं, और विफलताओं की विधि के रूप में इस तरह के तरीके presynaptic और postsynaptic समारोह में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 5. इमेजिंग presynaptic टर्मिनल Postsynaptic न्यूरॉन्स पैच विंदुक के माध्यम से विभिन्न रंगों से भरा जा सकता है. न्यूरॉन्स भी चयनित सेलुलर आबादी में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FPS) व्यक्त चूहों से बनाया जा सकता है है. Presynaptic टर्मिनल vibrodissociated चूहों कि विशेष interneuron आबादी में fps व्यक्त से बनाया न्यूरॉन्स पर visualized किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, ग्लूटामेट decarboxylase 65 (GAD65) प्रमोटर दिखाने हरे और hippocampal टोकरी कोशिकाओं और अन्य interneurons में somata प्रक्रियाओं द्वारा संचालित GFP व्यक्त चूहों. Hippocampal CA1 क्षेत्र से Vibrodissociated पिरामिड न्यूरॉन्स GFP पॉजिटिव अक्षतंतु टर्मिनलों उनके somata और प्रॉक्सिमल dendrites (चित्रा 1 ए) के लिए apposed है. चूहों से पिरामिड vibrodissociated कि व्यक्त synaptopHlourin (पीएच संवेदनशील GFP उत्परिवर्ती synaptic पुटिका जुड़े VAMP2 प्रोटीन के लिए जुड़े हुए) Thy1 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत भी FP-पॉजिटिव संलग्न BOUTONS कि पीएच संवेदनशील प्रतिदीप्ति (चित्रा 1 बी) दिखाने के न्यूरॉन्स. Presynaptic BOUTONS कैल्शियम सूचक रंजक और अन्य फ्लोरोसेंट अणु AM-esterified 5 यौगिकों का उपयोग कर के साथ लोड किया जा सकता है. चित्रा 2 कैल्शियम सूचक Fluo4-AM डाई का उपयोग कर लोड हो रहा है की एक उदाहरण दिखाता है. सबसे पहले, 1-2 सुक्ष्ममापी AM esterified डाई 10 मिनट के लिए 37 ° पर न्यूरॉन्स के लिए लागू किया जाता है. डाई intracellular वातावरण, जहां फोड़ना अणु esterases में घुसना, मुक्त, सेल impermeant और unquenched डाई उपज कर सकते हैं. इस दृष्टिकोण दोनों पूर्व और postsynaptic सेलुलर तत्वों लोड करता है. लोड हो रहा है, कोशिकाओं के बाद HEPES buffered खारा समाधान के साथ धो रहे हैं और एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए 37 डिग्री पर रखा. पहले एक ग्लास विंदुक इलेक्ट्रोड के साथ एक GΩ सील करने के लिए, कोशिकाओं बाह्य बफर समाधान के साथ 3 बार rinsed हैं. एक पूरे सेल रिकॉर्डिंग तो एक डाई मुक्त intracellular समाधान का उपयोग कर स्थापित है. रिकॉर्डिंग के 2-5 मिनट के बाद, डाई ज्यादातर postsynaptic न्यूरॉन से निकाल दिया जाता है, Fluo-4-लोड synaptic BOUTONS के दृश्य की अनुमति. इस तकनीक सुनो एट अल 5 ने बीड़ा उठाया था. डाई लोड BOUTONS तो कल्पना या तो एक कैमरा आधारित या multiphoton खुर्दबीन के साथ एक उच्च वृद्धि, उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का उपयोग कर सकते हैं. युगपत रिकॉर्डिंग पूरे सेल और कैल्शियम इमेजिंग एक के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है सेटअप का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. न्यूरॉन और चित्रा 2C में दिखाया BOUTONS की छवियों को एक इलेक्ट्रॉन गुणा प्रभारी युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरा के साथ कब्जा कर लिया गया. उत्तेजना के लिए प्रकाश स्रोत की शक्ति के साथ एक तटस्थ घनत्व 1.0 फिल्टर और एक परितारिका फिल्टर 12% के उत्पादन के लिए समायोजित 1.2% तनु किया गया था. हरी presynaptic BOUTONS से ​​कैल्शियम यात्रियों और मनाया जा सकता है वास्तविक समय में दर्ज की, और ऑफ़लाइन मापा. 6. प्रतिनिधि परिणाम: सहज और वर्तमान इंजेक्शन पैदा Vibrodissociated न्यूरॉन्स की फायरिंग एक ठेठ vibrodissociated hippocampal CA1 पिरामिड न्यूरॉन से रिकॉर्डिंग 4A चित्रा में दिखाए जाते हैं. स्वतःस्फूर्त overshooting कार्रवाई क्षमता पिरामिड चूहे basolateral प्रमस्तिष्कखंड, हिप्पोकैम्पस और 1,5 VTA से dissociated न्यूरॉन्स में मनाया जा सकता है. CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स से दौरान दबाना – वर्तमान रिकॉर्डिंग वर्तमान इंजेक्शन hyperpolarizing ठेठ वोल्टेज प्रतिक्रियाओं का उत्पादन, जबकि पर्याप्त परिमाण के depolarizing धाराओं ठेठ मध्यम मौजूदा स्तर और गैर मिलनसार कार्रवाई क्षमता के साथ मजबूत वर्तमान इंजेक्शन के लिए प्रतिक्रिया में देरी फायरिंग पैटर्न के साथ overshooting कार्रवाई क्षमता को प्रकाश में लाना ( 4B चित्रा). उठना और लघु Vibrodissociated न्यूरॉन्स में GABAergic निरोधात्मक postsynaptic धाराओं एक CSCL आधारित intracellular समाधान के साथ वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग के दौरान, सहज synaptic धाराओं (चित्रा 5A) मनाया जाता है. इन घटनाओं को कम कैल्शियम युक्त 2,6 समाधान में समाप्त हो जाते हैं, और सबसे neuronal प्रकार में पूरी तरह से bicuculline या gabazine (चित्रा 5B, सी) के रूप में एक रिसेप्टर antagonists, यह दर्शाता है कि इन GABA रिलीज और सक्रियण द्वारा मध्यस्थता sIPSCs कर रहे हैं GABA द्वारा अवरुद्ध कर रहे हैं इस ionotropic रिसेप्टर उप प्रकार के. हालांकि, basolateral प्रमस्तिष्कखंड 2 और उदर tegmental क्षेत्र 5,7, GABA एक रिसेप्टर नाकाबंदी जैसे मस्तिष्क क्षेत्रों से प्रमुख न्यूरॉन्स मेंकम अवधि AMPA प्रकार रिसेप्टर्स की glutamatergic सक्रियण द्वारा मध्यस्थता EPSCs पता चलता है. दिलचस्प है, TTX की सांद्रता है कि सबसे विष के प्रति संवेदनशील वोल्टेज gated सोडियम चैनल की नाकाबंदी के लिए विशिष्ट हैं पर आवेदन आवृत्ति और कई मस्तिष्क (चित्रा 6A) क्षेत्रों 2,4,7 से vibrodissociated न्यूरॉन्स में मनाया sIPSCs के आयाम को कम कर देता है. इस प्रकार, सोडियम चैनल गतिविधि pinched बंद synaptic BOUTONS में GABA रिलीज में भाग लेता है. यह अभी तक नहीं है स्पष्ट है कि अगर पूर्ण विकसित सोडियम कार्रवाई क्षमता इन टर्मिनलों में पाए जाते हैं. यह ध्यान देने योग्य बात है कि एक अच्छी तरह से सील 1 सुक्ष्ममापी व्यास अक्षतंतु टर्मिनल के इनपुट प्रतिरोध GΩ रेंज में अच्छी तरह से होने की संभावना है लायक है. इस प्रकार, भी सोडियम चैनल की एक छोटी संख्या के उद्घाटन के टर्मिनलों बिगाड़ना कैल्शियम चैनलों कि उत्तेजना स्राव युग्मन मध्यस्थता को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. इन कैल्शियम चैनल के विषय में, सबूत से पता चलता है कि एन और पी / Q प्रकार चैनलों hippocampal CA1 और 8 कहीं से vibrodissociated तैयारी में GABAergic टर्मिनलों पर रिलीज में भाग लेने. मॉडुलन और न्यूरोट्रांसमीटर और रिसेप्टर्स की संख्या से संचरण के plasticity vibrodissociated न्यूरॉन्स 3,4,9 का उपयोग करने के लिए जांच की गई. ऐसे modulatory कार्रवाई करने के लिए दिखाया न्यूरोट्रांसमीटर adenosine, GABA, serotonin, endocannabinoids, 2,6,10,11,12 आदि कर रहे हैं. इसके अलावा, अल्पकालिक जैसे endocannabinoid निर्भर निषेध (DSI) के विध्रुवण प्रेरित दमन synaptic plasticity, भी इस 2,11 तैयारी में वर्णित किया गया है . इन नतीजों से संकेत मिलता है कि रिसेप्टर की मध्यस्थता और अंतर्जात neuromodulators द्वारा पार synaptic संकेतन के कई रूपों vibrodissociated तैयारी में बरकरार हैं. कैल्शियम और Vibrodissociated तैयारी में यात्रियों Axon टर्मिनल में vesicular रिलीज EMCCD सुसज्जित उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग ऊपर का वर्णन करने के लिए, हम vibrodissociated न्यूरॉन bouton तैयारी में presynaptic टर्मिनलों में कैल्शियम यात्रियों की जांच की है. चित्रा 2 से पता चलता है एक hippocampal CA1 पिरामिड न्यूरॉन में हूँ esterified Fluo-4 और बाद में postsynaptic डाई कमजोर पड़ने के साथ सेल लोड हो रहा है. स्वतःस्फूर्त कैल्शियम यात्रियों कुछ डाई भरे हित के क्षेत्रों में चित्रा 6B (ROIs) के रूप में दिखाया गया BOUTONS में मनाया जाता है. 1 सुक्ष्ममापी tetrodotoxin (TTX) के आवेदन इन सहज यात्रियों समाप्त, यह दर्शाता है कि वे वोल्टेज gated सोडियम धाराओं कि अनायास BOUTONS में सक्रिय कर रहे हैं के सक्रियण द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं, बाद में कैल्शियम उगता करने के लिए अग्रणी. 10 मिमी से 40 मिमी के लिए तेजी से समाधान मुद्रा के साथ कोशिकी KCl बढ़ाने प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई उत्पादन के रूप में ROIs कि presynaptic टर्मिनल (चित्रा 7A) के अनुरूप में मापा. Postsynaptic न्यूरॉन से एक साथ रिकॉर्डिंग sIPSCs निगरानी और निर्धारित करती है कि घटना आवृत्ति उच्च + K विध्रुवण (चित्रा 7B) की वृद्धि हुई है के लिए प्रयोग किया जाता है. में पुटिका संलयन presynaptic BOUTONS हम व्यक्त synaptopHlourin Thy1 प्रमोटर (लेबल spH21 चूहों) के नियंत्रण के तहत निर्माण चूहों का इस्तेमाल किया है कल्पना करने के लिए. SynaptopHluorin एक आणविक निर्माण में जो में क्रांतिवृत्त (बढ़ाया पीएच संवेदनशीलता के साथ एक GFP उत्परिवर्ती) pHlourin 12 पुटिका जुड़े झिल्ली प्रोटीन (VAMP2) 13 से जुड़ा हुआ है. यह व्यवस्था पुटिका लुमेन जहां अपेक्षाकृत अम्लीय वातावरण प्रतिदीप्ति quenches में pHlourin आकृति situates. पुटिका संलयन होने पर इस आकृति puncta में एक प्रतिदीप्ति में परिणामी वृद्धि कि vesicles / presynaptic टर्मिनलों के अनुरूप के साथ और अधिक तटस्थ बाह्य वातावरण से अवगत कराया है. SpH21 चूहों से hippocampal न्यूरॉन्स के Vibrodissociation आकार और स्थान GABAergic टर्मिनलों (चित्रा 8A) के लिए उम्मीद की फ्लोरोसेंट puncta के दृश्य के लिए अनुमति देता है. आवेदन उच्च कश्मीर + बाह्य समाधान युक्त इन टर्मिनलों में प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, और इस प्रभाव में जो कोशिकी कैल्शियम 0.2 मिमी (चित्रा 8B) से कम है एक बाहरी समाधान की उपस्थिति में अवरुद्ध है. इस प्रकार, प्रतिदीप्ति में विध्रुवण प्रेरित वृद्धि न्यूरॉन bouton तैयारी में GABAergic synapses पर उत्तेजना – स्राव युग्मन प्रतिबिंबित होता है. presynaptic कैल्शियम यात्रियों और न्यूरॉन bouton तैयारी के अक्षतंतु टर्मिनलों में पुटिका संलयन उपाय करने की क्षमता हमें neuromodulators दुरुपयोग और presynaptic उत्तेजना स्राव युग्मन और exocytosis endocytosis / में शामिल तंत्र पर synaptic plasticity, दवाओं के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुमति देता है. इन तकनीकों में भी अन्य आणविक उपकरणों और अनुवांशिक इंजीनियर चूहों के साथ जोड़ा जा सकता है presynaptic समारोह मॉडुलन और / plasticity में विशेष रूप से प्रोटीन की भूमिका की जांच. चित्रा 1 hippocampal CA1 क्षेत्र से Vibrodissociated न्यूरॉन्स (ए) डीआईसी के विलय छवि.एक GAD65 माउस से एन डी हरी प्रतिदीप्ति छवियों. डीआईसी छवि हरी टर्मिनलों के स्थानों के लिए स्पष्ट रूप से एक synaptophluorin माउस (spH21) (बी) प्रतिदीप्ति छवि दिखाने के लिए विलय कर दिया है. स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी चित्रा 2 कैल्शियम सूचक लोडिंग प्रक्रिया: (ए) पूरे सेल AM esterified डाई के साथ भरी हुई है, (बी) पूरे सेल रिकॉर्डिंग डाई dilutes, (सी) टर्मिनल हित के क्षेत्रों (arrowheads) के रूप में कल्पना कर रहे हैं. चित्रा 3 एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग और vibrodissociated न्यूरॉन्स पर presynaptic टर्मिनलों में कैल्शियम इमेजिंग के लिए प्रयोगात्मक स्थापना के योजनाबद्ध आरेख. EMCCD = इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज डिवाइस युग्मित. चित्रा 4 प्रतिनिधि waveforms दिखा (ए) एक vibrodissociated CA1 न्यूरॉन से सहज कार्रवाई क्षमता और (बी) झिल्ली वोल्टेज प्रतिक्रियाओं hyperpolarizing और एक CA1 न्यूरॉन से वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग में वर्तमान इंजेक्शन depolarizing. चित्रा 5 (ए) एक CA1 पिरामिड न्यूरॉन से सहज IPSCs के प्रतिनिधि waveforms. या bicuculline (20 सुक्ष्ममापी; सी), (ई.पू.) IPSCs या तो (बी 10 सुक्ष्ममापी) gabazine द्वारा अवरुद्ध किया गया. चित्रा 6. TTX सहज GABAergic synaptic प्रसारण को रोकता है, और vibrodissociated hippocampal तैयारी में presynaptic कैल्शियम यात्रियों समाप्त. (ए) पहले एक vibrodissociated न्यूरॉन से और TTX आवेदन के दौरान रिकॉर्डिंग. आवृत्ति और sIPSCs के आयाम में कमी नोट. (बी) एक vibrodissociated न्यूरॉन पर एक Fluo-4-लोड presynaptic पहले टर्मिनल में और TTX आवेदन के दौरान कैल्शियम यात्रियों मनाया. यात्रियों की पूरी हानि नोट. 7 चित्रा साथ – साथ कैल्शियम सूचक इमेजिंग और sIPSC पूरे सेल रिकॉर्डिंग उच्च + K उत्तेजना के प्रभाव दिखा. (ए) प्रतिदीप्ति एक presynaptic Fluo – 04:00 डाई के साथ भरी हुई bouton से समय पर मापा. (ख) उच्च कश्मीर + अनुप्रयोग के दौरान sIPSC आवृत्ति और आयाम के साथ – साथ वृद्धि हुई है . 8 चित्रा Ca 2 + निर्भर उच्च कश्मीर spH21 hippocampal CA1 क्षेत्र से पिरामिड न्यूरॉन के presynaptic BOUTONS में प्रतिक्रिया. (ए) एक vibrodissociated न्यूरॉन के प्रतिदीप्ति छवि. (ख) उच्च कश्मीर + अनुप्रयोग (काली पट्टी द्वारा इंगित) हमारे सामान्य कोशिकी 2 Ca समाधान + युक्त (2 सीए 2 मिमी +) की उपस्थिति में एक प्रतिदीप्ति में निरंतर वृद्धि के परिणामस्वरूप. नहीं प्रतिदीप्ति वृद्धि कम कोशिकी Ca 2 + (0.2 मिमी 2 + Ca) में मनाया गया. ग्राफ में डाटा पूर्व उच्च कश्मीर + प्रतिदीप्ति स्तर सामान्यीकृत थे, और 3 BOUTONS से औसत प्रतिक्रिया दिखा.