C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스

1. 시스템을 조립 시스템의 특정 구성 요소는 다음과 같습니다. 제대로 조립하면, 사용자가 한 손으로 현미경을 집중할 수 있어야합니다, (중 마우 스나 조이스틱과 함께) 다른과 함께 무대를 이동 발 페달로 레이저를 활성화하고, 온 -을 확연히 볼 수있다 화면 이미지. MicroPoint 레이저 복합 현미경의 에피 형광 포트를 탑재. 우리는 니콘 80i를 사용하지만, 모든 연구 수준의 직립하거나 거꾸로 범위는 작동합니다. MicroPoint 시스템은 절단하고자하는 세포 라벨 형광단과 일치해야합니다 사용자 정의 이색성를 포함합니다. 대안 fluorophores와 라벨 커팅 세포가 추가 dichroics이 필요합니다. 또한, 펄스 발생기 및 발 페달은 MicroPoint 시스템을 함께. 100x, 1.4 NA 오일 수술을 수행하고 중생을 평가하기위한 목적뿐 아니라 슬라이드에 샘플을 위치에 필요한 추가적인 목표. 우리는 수술 니콘 계획 APO VC를 사용하여 4X가 거친 초점 샘플을 찾는 데 유용합니다 것을 발견했습니다. 조이스틱과 함께 무대를 동력. 무대에만 타겟팅에 사용되기 때문에 매우 높은 정확성과 repeatability있는 무대가 필요합니다. 우리는 전에 OptiScan II를 (토론 참조)을 사용합니다. 카메라. 카메라는 컴퓨터 모니터에 이미지를 떠올리면서, 초점과 100x 목적으로 표시된 neurite를 대상으로 충분한 프레임 속도를 제공해야합니다. 우리는 (아래 1.7 참조​​) 사진 표백 또는 손상의 가능성이 혼란함을 주죠 효과를 피하기 위해 axotomy 절차 동안 조명 광을 attenuating 선호합니다. 따라서, 카메라는이 빛을 감소 수준을 수용할 정도로 민감한해야합니다. 우리는 하마 마츠 오카 05G를 사용하고 16.3 Hz에서에서 이미지가 충분합니다 찾습니다. 상응하는 카메라가 대체 수 있습니다. 카메라를 운전할 수 컴퓨터, 모니터, 및 이미징 소프트웨어. 또한, 우리는 (토론 참조) 마우스 전동 무대를 조작하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 에어 테이블. 이 요구 사항은 지역에 따라 달라질 수 있지만 수술이 100x 목적으로 수행되기 때문에, 우리는 진동 절연은 필수적으로 찾습니다. 조명 가이드 및 형광단을 계몽을위한 셔터 메커니즘과 라이트 공급. 조명 가이드 MicroPoint에 연결합니다. 셔터 메커니즘은 독립적으로 레이저의 조명 강도를 줄이는 데 유용합니다. 우리는 이전 루멘 200 Leica EL6000를 사용하여 axotomy에 대한 전체 빛의 강도의 80 %까지 감쇠. 2. 레이저 설정 초기 정렬 및 레이저를 초점 자세한 프로토콜은 MicroPoint 레이저 시스템으로 제공됩니다. 우리는 그 절차가 초기 설정에 따라 성공적으로 뒤를되었습니다 가정합니다. 이것은 접안 렌즈의 주목을 가진 레이저를 정렬이 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 레이저의 초점과 강도의 정기적인 유지 보수를위한 프로토콜을 제공합니다. 로 MicroPoint 설명서에 명시된 바와 같이, 펄스 질소 레이저는 심각하게 인간의 눈을 손상시킬 수 있습니다. 치료는 레이저 빔을 직접 쳐다보지도 않을로 이동해야합니다. 일단 설치 장벽 필터 안전하게 eyepieces를 통해 방사선을 차단해야합니다. 유기체의 신경을 절단의 모래알의 크기는 도전하실 수 있습니다. 레이저에 의해 수행 피해 면적이 아주 작은이기 때문에 그것은 정확하게 샘플을 대상으로 위해 레이저의 초점의 3 차원 위치를 알고하는 것이 필수적입니다. 레이저 초점은 미러 슬라이드를 사용하여 발견된다. 첫째, 우리는 레이저 초점의 Z 위치는 이미지 경로의 초점과 일치하는지 확인하십시오. 다음 피해 초점의 XY 위치는 이미징 소프트웨어의 주목과 함께 표시됩니다. Z – 비행기에 초점 중립 밀도 필터 ND16 (그림 1A)에서 누르십시오. 우리는 집중하는 동안 레이저를 자제하는 에피 조명 경로에 중립 밀도 필터를 사용합니다. 에도 미세한 초점을 맞추고, ND16 및 ND4 형광 필터 모두에 밀어. 스위치 1 펄스에 MicroPoint 레이저를 세트 '선택'(그림 1B), 그리고 적절한 긴 도로 장벽 필터 (그림 1C)에 필터 휠을 이동으로 변하고있는 상황입니다. 무대에서 미러 슬라이드를 삽입하고 전달 빛을 사용하여 4X 목적으로 그 안에서 pinholes에 중점을두고 있습니다. 미러 슬라이드 침지 기름 한 방울을 추가하고 100X 목적으로 pinholes에 집중할. 레버 (그림 1D)와 레이저 셔터 (그림 1E)을 전환 광학 경로로 카메라 셔터를 엽니다. 필요한 경우 pinholes의 가장자리가 선명하므로, 전송 빛의 강도를 감소 : 이것은 정확하게 초점에 도움이됩니다. 발 페달을 누르십시오. 레이저가 제대로 초점을 맞추고있다면 이것은 거울에 작은 구멍을 생산해야합니다. 약간 미러 슬라이드의 비행기 위에 현미경을 집중하고 다시 레이저를 쏴. 이것은 심지어 작은해야첫 번째 총알보다 구멍, 또는 전혀 흔적을 남겨 두지 않습니다. 미러 슬라이드 아래에 초점을 맞춤으로써 반복합니다. 구멍이 2.5에서 생산되지 않은 경우, 또는 거울의 표면 위 또는 아래 초점을 때 큰 구멍이 생산하는 경우, 절제 머리에 초점 링과 함께 레이저를 집중할. 구멍이 여전히 제대로 접안 렌즈의 주목에 부합되는지 확인합니다. 일관성 사용, Z – 비행기의 초점은 거의 조정할 필요가 없다. XY 평면의 중심 위의 2.3을 통해 2.1 단계를 수행하여 미러 슬라이드에 작은 구멍을 만들기 위해 발 페달을 누르십시오. 시작 메뉴 요소 '수집'에서 모드를 캡처 '를 라이브. '측정'툴바 선택 '투자 수익 (ROI) 편집기'에서 다음 '더블 십자가'도구를 선택하고 새로운 구멍의 중앙에 그들을 정렬하기 위해 주목을 끕니다. 그리고 '종료 편집기'은 투자 수익 (ROI) 저장 '을하고 라이브 캡처 모드를 다시 클릭합니다. 마우스로 무대를 조작 요소의 '마우스 XY'설정을 활성화합니다. , 다시 원래 위치 (S)에 대한 중립적인 밀도 필터를 당겨 10 레이저 펄스를 설정하고, 미러 슬라이드를 제거합니다. 레이저의 전원을 조정 레이저의 능력은 선택의 신경 세포를 잘라하는 데 필요한 최소 전력으로 조정해야합니다. 생활 웜 (아래 설명) 깎다 감쇠기 판 (그림 1 층)을 이동하여 전력을 조정합니다. 레이저 전원이 너무 높으면, 그것은 주변 손상 시키거나 벌레 구멍을 폭발합니다. 레이저 전원이 너무 낮으면, 그것은 신경을 도려하지 않습니다. 시스템이 설치되면, 감쇠기 위치는 거의 변경할 필요가 없다. 레이저 약한되고, 감쇠기 플레이트가 절단 계속 이동해야하는 경우, 그것은 염색 세포에 염색이 (토론 참조) 교체해야한다는 서명 수 있습니다. 3. 벌레를 고정 3퍼센트 M9의 용융 아가로 오스 (22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 85mM NaCl, 1mM MgSO4)의 솔루션을 준비합니다. 15 ML 팔콘 튜브로 용융 아가로 오스의 5 ML 하는걸. 다른 튜브 물을 채우십시오. 모듈형 가열 요소에 장소 튜브 55 ° C. 설정 각 튜브 미니 물 목욕을 만들 물로 가열 요소를 채웁니다. 참고 : 아가로 오스는 미리 대량으로 준비하고 후속 실험에 다시 녹아 수 있습니다. 이 슬라이드의 각 이러한 슬라이드 사이에 깨끗한 슬라이드에 라벨 테이프 두 레이어를 놓습니다. 깨끗한 슬라이드 및 그 결과 아가로 오스 패드 테이프 두 조각 (그림 2)의 두께가되도록 첫 번째 장소 다른 슬라이드 직각을 중간에 플라스틱 전구의 피펫을 사용하여 아가로 오스의 드롭을 분배. 30초 후 패드에서 두 슬라이드 중 하나를 제거합니다. 린스 이후 슬라이드와 함께 사용하기 위해 물 채워진 팔콘 튜브의 플라스틱 피펫을 저장합니다. 다음 장소 패드의 중앙에 0.10 μm의 또는 0.05 μm의의 폴리스티렌 구슬 3-5 μL. 관심의 뉴런에 형광 단백질을 표현 50-10 벌레를 추가합니다. 관심의 뉴런이 불균형 웜의 오른쪽이나 왼쪽에 배포하는 경우, 올바른 측면가 직면되도록 벌레를 돌려 플래티넘 선택을 사용합니다. 웜는 아가로 오스 패드 준비 10 분 이내에 슬라이드에 삽입되어야합니다. 조심스럽게 벌레에 커버 전표를 놓습니다. 커버 슬립을 배치하면, 이것은 표피를 방해하고 벌레를 파괴하므로 아가로 오스 패드로 상대 이동하지 않습니다. 현미경 단계에 준비된 슬라이드를 놓습니다. 4. 컷 뉴런 광학 경로 스위칭 레버와 eyepieces에 직접 빛을. 4X 목적으로 절단하는 벌레에 초점, 커버 슬립에 기름 한 방울을 배치하고, 100X 목표로 전환합니다. 카메라 광학 경로를 반환합니다. 십자형 커서의 중앙 아래에 선택의 신경 세포를 이동하려면 마우스를 사용합니다. 레이저를 발사하기 위해 발 페달을 눌러 프로세스의 연결을 끊을 수. 필요한 경우, 펄스의 두 세트는 신경을 도려 사용할 수 있습니다. 처음에는 그것은 뉴런이 이후의 재생을 평가하기 위해 각각의 벌레에 심했을텐데 보유하고있는 정확하게 추적하기 위해 도움이됩니다. 제대로 수행되면, 레이저 axotomy은 주변 피부 조직이나 다른 뉴런 (그림 3 참조)에 상당한 손상을 초래하지 않고 신경 세포의 작은 휴식을 생산하고 있습니다. 어떤 경우에는 작은 상처는 부상의 사이트의 주위에 양식 있습니다. 벌레는 아가로 오스 패드에 남아있을 것을주의하고, 직접 상향 움직임에 커버 슬립을 제거하여 벌레를 복구합니다. coverslip를 밀어하지 마십시오. 그런 다음, 바늘 코를 집게로 웜 주변의 패드를 잘라 OP50 8 포함된 갓 씨앗 NGM의 접시에 아가로 오스의 섹션을 놓으십시오. 구슬에서 벌레를 무료로 아가로 오스를 제거하는 패드에 멸균 M9 10 μL를 놓습니다. 5. 재생에 대한 점수 뉴런 단계 2.2에 명시된 바와 같이 아가로 오스 패드를 준비합니다. 3-5 &에 플레이스 웜뮤, 폴리스티렌 구슬 L. coverslip을 적용합니다. 슬라이드는 순차적으로 준비하거나, 또는 모든 벌레는 사전과 10cm 문화 요리, 아가로 오스의 촉촉한을 유지하기 위해 습기가 Kimwipe를 포함하는 각에 보관 슬라이드에 준비하실 수 있습니다. 잘린 신경을 시각화하기 위해 100X 목적을 사용합니다. 많은 뉴런에서 절단 사이트에 말초의 연결 그루터기가 유지됩니다. 우리는 신경 세포가 실제로 (그림 4) 절단이라고 ​​표시로 잔여의 존재를 사용합니다. 이 유세의 존재는 그것이 가능 잘라 아니었 하나 잘라 생성되었습니다 신경 세포를 구별할 수 있습니다. 참고 : 모두 말초 및 근위 스텀스 처음 절단 후에 철회. 중생을 평가합니다. 매개 변수의 다양한 결정하실 수 있습니다. 하나의 간단한 분석은 부상당한 신경 세포가 성장 원뿔 (그림 4A)을 형성하고 (그림 4B)하지 생성, 또는이 있는지 여부입니다. 또는, neurite의 길이는 추적하고 비교할 수 있습니다. 6. 대표 결과 예를 들어, 우리는 γ – Aminobutyric의 산성 (GABA) 모터 뉴런의 중생의 특성을 설명합니다. 복부 신경 코드에 거주하고있는 특정 신경 코드에 circumferentially 프로세스를 확장하는 이들 뉴런은, 적절한 운동 9 필수적입니다. GABA의 신경은 UNC -47 또는 UNC의 통제 -25 발기인 (C. 엘레간스 유전 센터에서 사용할 종자 각각 EG1285 및 CZ1200, 아래와 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 같은 유전자 인코딩 형광단을 표현하여 시각 수 있습니다 ). 마운트 L4 단계의 웜은으로 설명, 자신의 오른쪽 측면에있는 GABA 뉴런가 직면하므로 벌레를 플립하고, 표지 용지를 넣으십시오. 지느러미와 복부 코드 사이의 각 웜, 미드웨이에서 사후 commissures의 1-3 컷. 다음과 같이 다른 commissures와 교차 또는 fasciculate 나중에 점수 어렵다는 것을 commissures을 절단하지 마십시오. 설명한대로 벌레를 복구할 수 있습니다. 18~24시간 성공 axotomy 후, 웜는 수술에서 회복하고 정상적인 locomotory 달걀 누워있는 행동을 전시됩니다. 죽거나 아픈가요 벌레를 폐기하십시오. 설명된대로 나머지를 리마운트하고, 중생을 평가합니다. 우리는 일반적으로 실험 조건마다 적어도 30 컷 뉴런을 평가하는 것을 목표로하고 있습니다. oxIs12 동물, 절단 L4 GABA 뉴런의 일반적 60-70%은 끝에 여러 neurite 지점의 확장에 막의 확대, 그리고 컷 사이트 (그림 4A)에서 마이 그 레이션에 의해 입증 성장 원뿔 구조를 시작합니다. 대부분의 경우에는 성장 콘은 지느러미 신경 코드, 인근의 연결을 접합면 또는 말초 그루터기와 재연결으로 마이 그 레이션해야합니다. 뉴런의 나머지 30 % 중 axotomy의 사이트에 근위 그루터기을 형성, 아무 성장을 시작하지 않았기에, 아니면 작은 filopodia (그림 4B)을 확장합니다. 그림 1. UV 레이저 axotomy 시스템을 펄스. 특정 구성 요소는 다음과 같습니다 (A) ND 필터는 (B) 펄스 선택 (C) 필터 휠 레버 (D) 레버 (E) 레이저 셔터 및 (F) 감쇠기 플레이트 전환 광학 경로입니다. 그림 2. 아가로 오스 패드를 준비. 원하는 두께의 아가로 오스 패드를 준비하려면, 테이프의 두 계층은 (녹색) 2 슬라이드에 표시됩니다. 슬라이드는 첫 번째와 두 번째 사이에 위치하고, 아가로 오스의 드롭은 다음 깨끗한 슬라이드에 추가됩니다. 마지막으로 네 번째 슬라이드 테이프 두 조각의 두께는 패드의 결과, 처음 세에 수직으로 배치됩니다. 그림 3. 대표 GABA 신경 세포의 axotomies. 전형적인 실험에서는 GABA 신경 세포의 commissures는 웜 측면의 중간에서 절단됩니다. 절단 접합면 바로 전 (왼쪽 패널) 및 (오른쪽 패널) axotomy 후 표시됩니다. 모든 이미지는 100X 오일 목적으로 찍은. 그림 4. GABA 신경 세포의 axotomies 대표 발생합니다. 24 시간 이후 axotomy 절단 axons은 중생에 대한 점수입니다. 성장 원뿔 (화살표)와 재생의 축삭은 (A)가 아닌 재생 축삭은 (B)에서 근위 그루터기 (화살표)로 볼 수있는 동안에 표시됩니다. 각 컷 축삭의 말초 그루터기는 각 패널 (화살촉)에 표시하고 축삭이 절단되었다는 표시입니다.