마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation
Summary
우리는를 보여<em> 생체내에</em망막 신경절 세포 (RGCs)과 연령대의 넓은 범위에서 출생 후의 생쥐의 다른 망막 세포 유형의 단일 또는 소규모 클러스터를 transfecting위한> electroporation 프로토콜. 라벨과 유전 출생 후의 RGCs를 조작하는 능력<em> 생체내에</em> 발달 연구를위한 강력한 도구입니다.
Abstract
midbrain에 RGC 예측의 대상 및 개선 개발하는 동안 신경 연결 양식의 방법은 정확한 패턴을 공부에 대한 인기있는 강력한 모델 시스템입니다. 생쥐에서 retinofugal 전망은 시상 및 우수 Colliculus (SC)의 래터럴 Geniculate 핵의 지형 방식과 양식 눈 특정 레이어 (dLGN)에 정렬됩니다. retinofugal 예측 이러한 정확한 패턴의 개발은 일반적으로 같은 양고추냉이 퍼옥시데이즈 1-4로 형광 염료와 추적기와 RGCs의 인구를 분류하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 방법은 retinotopic지도 형성의 기초있는 개별 RGC axonal 아버 형태의 발달 변화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 너무 거칠어. 또한 RGCs의 유전자 조작에 대한 허용하지 않습니다.
최근 electroporation은 망막 5-11로 청구 분자의 제공을위한 정확한 공간과 시간적 제어를 제공하는 효과적인 방법이되었다. 현재 망막 electroporation 프로토콜은 유전자 조작을 허용하고 출생 후의 생쥐에 RGCs의 단일 또는 작은 클러스터의 retinofugal 예측을 추적하지 않습니다. 그것은 생체내의 electroporation에 출생 후의이 상표 효율이 매우 낮은이기 때문에 RGCs를 transfecting위한 가능한 방법이 아니므로 그러므로 RGC progenitors가 분화 및 증식 6 겪고 아르 배아 연령 타겟팅에 필요하다는 주장했습니다.
이 비디오에서 우리는 타겟 유전자의 전달, shRNA, 및 postnatally murine RGCs에 형광 dextrans에 대한 생체내의 electroporation 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 분기, 라미네이션, 재생 및 회로 개발의 다양한 단계에서 버렸네 형성, 축삭의 철회를 포함한 신경 발달의 여러 측면에 관련된 후보 유전자의 효율적인 심사를위한 빠르고 효율적인 비용과 상대적으로 쉬운 플랫폼을 제공합니다. 요약 우리는 여기에 감각지도 개발을 기본 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 것입니다 가치있는 도구를 설명합니다.
Protocol
Discussion
이 비디오에서 우리는 생체내의 electroporation 프로토콜에을 입증되는 형광 단백질을 인코딩 DNA 구조와 출생 후의 생쥐의 망막 뉴런의 단일 또는 작은 클러스터의 라벨을 초래합니다. 이전 연구 그 electroporation 정상 RGC 축삭 아버 상세 검색을 방해하지 않았 의미, lipophilic 염료와 RGC 라벨을 사용하는 것과 dLGN와 SC에 찬란 분류 RGC 예측의 작은 클러스터는 유사한 프로젝션 패턴을 재현. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pCAG – gapEGFP 플라스미드 박사 S. 맥코넬 (스탠포드, CA)에서 선물했다. pCAG – tdTomato 플라스미드 박사 M. 펠러 (버클리, CA)에서 선물했다. 우리는 기술 지원을위한 시험 연구와 Crair 연구소 회원에 두 개의 플라스미드 Cre 호텔 / loxP 전략을 검증을위한 단일 셀 라벨 앤 Schohl (몬트리올, QC)에 대한 두 플라스미드 전략의 사용을 제안 박사의 에드워드 Ruthazer 감사합니다. R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC)와 NIH P30 EY000785 (MC) 지원.
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
References
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