La inducción de anergia aloantígenos específicos en las células mononucleares de sangre periférica mediante estimulación aloantígeno con bloqueo de señales co-estimuladoras
Summary
Este artículo describe una técnica simple para inducir aloantígenos específicos de anergia en las células mononucleares de sangre periférica. La técnica puede aplicarse clínicamente para generar no aloreactivas células del donante. La infusión de estas células podría mejorar la reconstitución inmune y reducir la toxicidad después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.
Abstract
Alogénico de células madre hematopoyéticas (AHSCT) ofrece la mejor oportunidad de cura para muchos pacientes con enfermedades hematológicas congénitas y adquiridas. Por desgracia, el trasplante de células del donante aloreactivas T que reconocen y dañar los tejidos sanos del paciente puede resultar en la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) 1. Uno de los retos a AHSCT éxito es la prevención de la EICH sin deterioro asociado de los efectos beneficiosos de las células T del donante, la reconstitución inmune en particular y la prevención de la recaída. EICH se puede evitar no específica agotamiento de las células T del donante de los injertos de células madre o por la administración de la inmunosupresión farmacológica. Lamentablemente, estos enfoques infección aumentan y la enfermedad recaída 2-4. Una estrategia alternativa es agotar selectivamente células T alorreactivas donante después de allostimulation antígeno por las células que presentan receptores (APC) antes del trasplante. Los primeros ensayos clínicos de estas estrategias allodepletion mejorar la reconstitución inmune después de HLA diferente TCMH sin exceso de EICH 5, 6. Sin embargo, algunas técnicas requieren allodepletion especializados receptor producción APC 6, 7 y algunos enfoques pueden tener efectos fuera del objetivo como el agotamiento de los donantes de patógenos específicos de las células T CD4 8 y las células T reguladoras 9. Un enfoque alternativo es la inactivación de las células T del donante aloreactivas a través de la inducción de aloantígenos específicos de respuesta menor. Esto se logra estimulando las células del donante con el receptor de APC mientras que proporciona el bloqueo de CD28 mediado por la estimulación de señales co-10. Este "alloanergization" enfoque reduce alorreactividad por 1-2, preservando los registros de agentes patógenos y el tumor de antígeno asociado a las respuestas de células T in vitro 11 . La estrategia ha sido empleado con éxito en dos completado los estudios en curso y un clínico piloto en el que las células T del donante alloanergized fueron infundidos durante o después de HLA diferente TCMH resultantes de una reconstitución rápida inmunológico, infecciones y algunos EICH aguda y crónica menos graves que los receptores de control histórico de sin manipular con HLA diferente del trasplante 12. A continuación se describe el protocolo actual para la generación de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) que han sido alloanergized de HLA diferente PBMC estimulador no relacionados. Alloanergization se logra allostimulation en presencia de los anticuerpos monoclonales a los ligandos B7.1 y B7.1 para bloquear CD28 mediada coestimulación. Esta técnica no requiere la producción de APC especializados estimulador y es fácil de realizar, que requieren sólo un vivo sola y relativamente breve ex etapa de incubación. Como tal, el enfoque puede ser fácilmente estandarizados para el uso clínico de generar células T del donante con alorreactividad reducción de patógenos, pero conservando la inmunidad específica para la transferencia adoptiva en el marco de AHSCT para mejorar la reconstitución inmune sin EICH excesivo.
Protocol
<p class="jove_title"> 1. Preparación de PBMC</p><ol><liprocedimientos> de una buena técnica aséptica y las precauciones universales deben cumplirse durante la realización de este protocolo.</li><li> Aislar PBMC de donantes voluntarios sanos por centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque. Por otra parte PBMC criopreservados pueden ser resucitadas.</li><li> Contar PBMC viable después de la tinción con azul tripán usando un hemocitómetro. Volver a suspender las PBMC en medios de cultivo completo (CM) a una concentración de 1 millón de células viables / mL en un tubo de 15 ml Falcon.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Configuración del Alloanergizing granel Co-cultura</p><ol><li> PBMCs de dos donantes distintos son necesarios para establecer las culturas alloanergization. Las células de un donante, será la respuesta y las células de otro donante servirá como el estimulador (denominado estimulador primera parte).</li><li> Colocar 10 millones estimulador PBMC en 1 millón / ml en un tubo Falcon de 15 ml y añadir 100 mg de anti-B7.1 y B7.2 de 100 mg de anti anticuerpos para bloquear la coestimulación. Agite suavemente el tubo y se incuba durante 30 minutos. Las condiciones de incubación para este y todos los pasos posteriores son de 37 ° C CO / 5%<sub> 2</sub> / 80% de humedad</li><li> Irradiar estimulador PBMC (3,3 Gy) y añadir 50 cm a un T-25<sup> 3</supCélula> la cultura matraz con un tapón de gas permeable. La etiqueta del frasco "a granel alloanergizing co-cultivo".</li><li> Añadir 10 ml de respuesta PBMC (menos 1 millón / ml en CM) en el matraz.</li><li> Añadir una 100mg cada una de las más anti-B7.1 y B7.2 anticuerpos contra y mezclar suavemente antes de colocar el frasco en posición vertical en una incubadora durante 72 horas</li></ol><p class="jove_title"> 3. Configuración del mando a granel Co-cultura</p><ol><li> Colocar 10 millones estimulador PBMC (menos 1 millón / ml) en un tubo de 15 ml Falcon.</li><li> Irradiar 10 millones estimulador PBMC (3,3 Gy). Y agregar a una de 50 cm<sup> 3</supCelular> frasco de cultivo. Etiqueta de "a granel de control de co-cultivo".</li><li> Añadir 10 ml de PBMC de respuesta a 1 millón / ml en la CM en el matraz y mezclar suavemente antes de colocar el frasco en posición vertical en una incubadora durante 72 horas.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Configuración de la reacción primaria de linfocitos mixtos (MLR) para medir la eficacia del bloqueo co-estimuladoras</p><ol><li> La eficacia del bloqueo co-estimuladoras se mide en una primaria MLR que se configura mediante PBMC de la alloanergizing a granel y el control de co-cultivos</li><li> La MLR primaria se configura en el mismo día en que los cultivos a granel se han establecido</li><li> En primer lugar una etiqueta U fondo 96 y placa "Primaria MLR" para cada uno de los tres puntos de tiempo a medir (Día 4, 5 y 6 después de que las placas se instalan).</li><li> 5 ml de cada una de decantar el control de volumen y alloanergizing co-cultivos en tubos Falcon de 15 ml.</li><li> Pipeta 200 ml de suspensión celular de cada tubo Falcon en tres pozos en cada plato. Etiqueta de estos pozos "no bloqueo coestimuladoras (CSB)" para que las células de la mayor parte de control de co-cultivos y "CSB" para las células de la masa alloanergizing co-cultivos</li><li> Añadir 200 ml de CM a 6 pozos en cada plato como controles negativos. 200 ml de PBS se añade a todos los pocillos vacíos para reducir la evaporación. Coloque las placas en la incubadora.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Configuración de la secundaria MLR para medir la eficacia de Alloanergization</p><ol><li> 72 horas después de la creación de la mayor parte co-cultivos, alloresponses residual en PBMCs alloanergized se miden en una secundaria MLR. En la secundaria MLR, PBMC de los dos la mayor parte alloanergizing co-cultivo y el control de volumen de co-cultivo se lavan y se volvieron a estimular con PBMC irradiadas allostimulator</li><li> Para configurar la etiqueta secundaria MLR un fondo de U 96 y placa "MLR secundaria" para cada uno de los tres puntos de tiempo a medir (Día 3, 5 y 7 después de la instalación).</li><li> Eliminar 5 ml de cada una de las de control de volumen y alloanergizing co-culturas, la transferencia de 15 ml tubos Falcon y centrifugar durante 5-10 minutos a 2000 rpm.Aspirate el sobrenadante con cuidado, perturbar el sedimento, agregar 10 ml de CM y centrifugar las células de nuevo. Repita este paso de lavado.</li><li> Resuspender las células en 1 ml de la CM. Contar las células viables mediante la tinción de azul de tripano, y ajustar la concentración celular de 1 millón de células viables de respuesta / mL.</li><li> Pipeta 100 ml de suspensión celular de cada tubo Falcon en tres pozos de cada plato. Etiqueta de estos pozos "del Partido Primero (FP) allorestimulation"</li><li> Pipeta 100 ml de suspensión celular de cada tubo Falcon en otros 3 pozos en cada plato y la etiqueta de estos pozos "CD3/28 estimulación"</li><li> Para preparar células estimuladoras de la secundaria MLR, aislar PBMC de la sangre fresca (o resucitar criopreservados PBMC) de la misma donante sano utilizado para la primera entrega PBMCs estimulador del partido en el alloanergizing y control de las culturas.</li><li> Suspender PBMC del donante PF a una concentración de 1 millón / mL e irradiar (3.3Gy)</li><li> Añadir 100 ml de células estimuladoras irradiadas a los pozos con la etiqueta "allorestimulation FP"</li><li> Para los controles positivos, agregar 1 ml cada una de CD3 y CD28 anticuerpos monoclonales y 98mL de CM a los pozos con la etiqueta "estimulación CD3/28". Añadir 200 ml de CM a 6 pozos en cada plato como un control negativo y 200 ml de PBS a los pocillos vacíos. Coloque las placas en la incubadora.</li></ol><p class="jove_title"> 6. La medición de la especificidad de Alloanergization</p><ol><li> La especificidad de alloanergization se determina mediante la comparación de la proliferación de células de respuesta tomada de la alloanergizing completado y el control de co-cultivos después de la estimulación con PBMC irradiadas obtenidos a partir de una "tercera parte" de los donantes sanos (es decir, un donante diferente a la Primera Parte) en una secundaria MLR.</li><li> Etiqueta de tres placas de 96 y "Especificidad secundaria MLR" Día 3, 5 y 7.</li><li> Eliminar 5 ml de cada una de las de control de volumen y alloanergizing co-cultivos de transferencia de 15 ml a tubos Falcon y centrifugar durante 5-10 minutos a 2000 rpm. Aspirar el sobrenadante con cuidado, perturbar el sedimento, agregar 10 ml de CM y centrifugar las células de nuevo. Repita este paso de lavado.</li><li> Resuspender las células en 1 ml de la CM. cuenta mediante la tinción de azul de tripano, y ajustar la concentración celular de 1 millón de células viables de respuesta / mL.</li><li> Para preparar células estimuladoras tercera parte de la secundaria MLR, aislar PBMC de la sangre fresca (o resucitar criopreservados PBMC) de un donante sano nuevo. Pipeta 100 ml de suspensión celular de cada tubo Falcon en tres pozos de cada plato. Etiqueta de estos pozos "TP allostimulation"</li><li> Suspender PBMC de un donante TP en 1 millón / ml e irradiar (3,3 Gy)</li><li> Añadir 200 ml de células irradiadas estimulador TP a los pozos con la etiqueta "allostimulation TP"</li><li> La especificidad de alloanergization también se puede determinar mediante la comparación de la proliferación de células de respuesta tomada de la alloanergizing completado y el control de co-cultivos después de la estimulación con un patógeno infeccioso como el CMV. Para este paso es esencial para el uso de respuesta de los donantes con PBMC demostrado previamente la respuesta proliferativa a CMV lisado.</li><li> Etiqueta de tres placas de 96 y "secundaria MLR CMV" Día 3, 5 y 7.</li><li> Para preparar las células de respuesta para la secundaria MLR para medir las respuestas CMV, la transferencia de 5 ml de cada una de las de control de volumen y alloanergizing co-cultivos de tubos de 15 ml y lavar, contar y volver a suspender en 1 millón de células / ml en el CM como se describió previamente . Pipetear 100 ml de suspensión celular de cada tubo Falcon en un 3 pozos en cada plato.</li><li> Añadir 0,1 ml de lisado de CMV en 100 ul CM a los pozos</li><li> Añadir 200 ml de CM a 6 pozos en todas las placas de control negativo y añadir 200 ml de PBS a los pocillos vacíos. Coloque las placas en la incubadora.</li></ol><p class="jove_title"> 7. La medición de la proliferación en la MLR de Primaria y Secundaria</p><ol><li> Proliferación de las células de respuesta se mide por el ensayo de timidina en el MLR primaria y secundaria. Proliferación se mide en el Día 4, 5 y 6 después de la Primaria placas MLR se establecen y en el Día 3, 5 y 7 después de la secundaria placas MLR se establezcan.</li><li1mci> de timidina tritiada se añade a los pozos de 16 horas antes de la cosecha</li><li> Después de la adición de timidina tritiada, la placa se incuba durante una hora después further16 recogieron sobre una estera de filtro usando una cosechadora Tomtec (o similar). Seque al aire la Filtermat durante una hora y coloque en una bolsa de muestra, añadir 5 ml de líquido de centelleo y el sello. Leer la placa en un centelleo Wallac Micro beta de venta libre o similares.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Cálculo de la eficacia del bloqueo co-estimuladoras en las primarias de MLR</p><ol><li> El porcentaje de inhibición (PI) de alloresponses primaria se calcula como 100 x [media cpm en allostimulation pozos (a granel alloanergy co-cultivo de PBMC) – media cpm en allostimulation pozos (mayor control de co-cultivo de PBMC)}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" ></ol><p class="jove_title"> 9. El cálculo de la eficacia de Alloanergization en la secundaria MLR</p><p class="jove_content"> El PI de alloresponses secundaria se calcula como<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" ><p class="jove_title"> 10. El cálculo de la especificidad de Alloanergization en la secundaria MLR</p><ol><li> Después de re-estimulación de las células con CD3 y CD28, allostimulators TP o antígeno de CMV, la PI de las respuestas a estos estímulos también se puede calcular con esta fórmula. Esto da una medida de la especificidad del proceso de alloanergization</li></ol><p class="jove_title"> 11. La generación de PBMC de donantes Alloanergized para el uso clínico después de Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (TCPH)</p><ol><lipbmc> Alloanergized donantes pueden ser generados para su uso clínico después de HLA diferente TCPH alogénicos usando el protocolo descrito anteriormente</li><li> Cuando la generación de células para uso clínico, respuesta PBMC se obtienen de los donantes TCMH y PBMC estimulador del receptor TCMH antes del trasplante.</li><li> Cuando se genera PBMC para uso clínico, todos los pasos se llevan a cabo en buenas condiciones de fabricación por procesos en las instalaciones de procesamiento de células madre acreditados.</li><li> Más ensayos de control de calidad se realizan incluyendo ensayos de endotoxinas y la tinción de Gram y cultivo para cumplir con los criterios de seguridad antes de la liberación de células para uso clínico</li></ol><p class="jove_title"> 12. Resultados representante</p><p class="jove_content"> Uso de HLA diferente estimulador y PBMC de respuesta, la presencia de bloqueo coestimuladoras en las primarias de MLR reduce alloproliferation media de respuesta PBMC en el día 5 a un 30% (+ / – 10%, la media + / – desviación estándar) de la que se observa en MLR de control primario en ausencia de bloqueo co-estimuladoras. Esto es equivalente a la inhibición media de alloproliferation primaria de alrededor del 70% (+ / – 10%) a D5,<strong> Figura 1 A y B</strong>.</p><p class="jove_content"> En la secundaria MLR en el día 5, alloproliferation FP de PBMC alloanergized es normalmente entre un 10-15% (+ / – 10%) de la que se observa con el control de PBMC equivalente a una inhibición media de la proliferación de 85-90% (+ / – 10 %),<strong> Figura 2 A y B</strong>. Esto demuestra que PBMC alloanergized se hiporrespuesta a allostimulators FP.</p><p class="jove_content"> En contraste PBMC alloanergized suelen conservar el 70-100% de su proliferación a mitógenos (CD3/CD28 anticuerpos), allostimulators TP y lisado CMV (CMV-reactiva en donantes). Esto demuestra que una respuesta menor de PBMC alloanergized es específico de FP aloantígenos.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figura 1. A.</strong> Proliferación (determinada por la incorporación de timidina) en una reacción mixta de linfocitos primarios con HLA diferente y estimulador de las células mononucleares de sangre periférica de respuesta (CMSP) en la ausencia o la presencia de bloqueo de coestimulación utilizando monoclonal humanizado anti-B7.1 y B7.2- anticuerpos. Los resultados se muestran como media (+ /-SD) de 8 experimentos usando representante único estimulador de respuesta pares.<strong> B</strong>. Porcentaje de inhibición de alloproliferation en MLR primaria realizada en presencia de bloqueo de coestimulación utilizando monoclonal humanizado anti-B7.1 y B7.2-anticuerpos. Los resultados se muestran como media (+ /-SD) para el mismo 8 único estimulador de respuesta pares muestra en la Figura 1A.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figura 2. A.</strong> Proliferación (determinada por la incorporación de timidina) en MLR secundaria en respuesta PBMC de MLR primaria realizada en ausencia (control PBMC) o la presencia de bloqueo de coestimulación (alloanergized PBMC) se volvieron a estimular con estimuladores irradiados primera parte. Los resultados se muestran como media (+ /-SD) para los 8 único estimulador de respuesta pares muestra en la Figura 1.<strong> B</strong>. Porcentaje de inhibición de alloproliferation primer partido en MLR secundaria en respuesta PBMC de MLR primaria realizada en ausencia (control PBMC) o la presencia de bloqueo de coestimulación (alloanergized PBMC) se volvieron a estimular con estimuladores irradiados primera parte. Los resultados se muestran como media (+ /-SD) para los 8 único estimulador de respuesta pares muestra en la Figura 1 y Figura 2A.</p>
Discussion
<p class="jove_content"> La inducción de aloantígenos específicos de respuesta menor, o anergia, en PBMC de donantes a través de allostimulation en presencia de bloqueo de co-estimulación es una técnica sencilla para la generación de PBMC de donantes con alorreactividad reducido. Hemos desarrollado el proceso en el laboratorio y en la actualidad la aplicación de la estrategia en la clínica para generar PBMC de donantes con alorreactividad reducido para perfusión después de HLA diferente TCPH alogénicos. El objetivo de la utilización de este tratamiento es mejorar la reconstitución inmune sin toxicidad excesiva. A pesar de nuestra aplicación clínica actual de la estrategia se limita a la fijación de los pacientes TCPH alogénicos, el enfoque podría aplicarse a otros ámbitos donde se produce daño en los tejidos no deseados por las respuestas de células T, tales como el rechazo del trasplante de órganos sólidos o enfermedades autoinmunes.</p><p class="jove_content"> Varios reactivos se pueden utilizar para el bloqueo de la coestimulación mediada por CD28-las señales durante el alloanergization co-cultivo proceso. A continuación se describe el protocolo actual con grado clínico humanizado anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra los ligandos de CD28 (B7.1 y B7.2). No de grado clínico anticuerpo anti-humano B7.1 y B7.2 anticuerpos están comercialmente disponibles de varios fabricantes. Por otra parte, la proteína de fusión de linfocitos T citotóxicos antígeno (CTLA) 4-Inmunoglobulina (Ig) se puede utilizar para bloquear la coestimulación CD28-durante el proceso de alloanergization. CTLA4-Ig, que consiste en la porción extracelular de la molécula CTLA4 relacionado con el receptor Fc gamma IgG, se une con alta afinidad a B7.1 y B7.2. El uso de CTLA4-Ig resultados de eficacia similar y una especificidad del alloanergization de PBMC humanos.</p><p class="jove_content"> La técnica de alloanergization es fácil de realizar. PBMCs estimulador frescos o criopreservados previamente se puede utilizar con una variación significativa en el resultado del proceso. El requisito de un solo paso de incubación relativamente breve ex vivo de células sin procedimientos de clasificación se minimice el potencial de la muerte celular y la contaminación bacteriana de las células antes de la infusión que hace que la estrategia relativamente simple de aplicar en una escala clínica.</p><p class="jove_content"> Una de las limitaciones del enfoque que describen (y otros métodos para reducir de forma selectiva alorreactividad de las células humanas) es la ausencia de una prueba en tiempo real para determinar alorreactividad residual. Ensayos de proliferación tener 3-5 días para llevar a cabo para confirmar la reducción de la alorreactividad y células generadas para su uso clínico debe ser infundido antes de los resultados de estos ensayos están disponibles. Además, la medición de la proliferación de PBMC por la incorporación de timidina, aunque fácil de realizar, las medidas de la proliferación de células B y otros subconjuntos de células, además de la proliferación de células T. CFSE dilución tinte de respuesta PBMCs se puede utilizar como un ensayo alternativo y permite la determinación de células T subconjunto específico de alloproliferation. Una forma de mejorar la aplicación clínica de nuestro enfoque de la estrategia sería la de desarrollar y validar un ensayo de alorreactividad que toma sólo un par de horas para llevar a cabo lo que podría llevarse a cabo antes de la liberación de células alloanergized para uso clínico.</p><p class="jove_content"> Además de demostrar la efficiacy de la estrategia también es importante para confirmar el proceso alloanergization especificidad. Esto se puede hacer fácilmente mediante la determinación de la relativa preservación de alloresponses específicas para allostimulators terceros y cuando CMV-reactiva las células del donante se alloanergized, por la preservación de la respuesta proliferativa a CMV</p>
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> Con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (Sub-19 y CA100625 CA137645 R21). JKD fue apoyado por la Sociedad de Leucemia y Linfoma y la Sociedad Americana de la concesión de Sangre y Médula Ósea Investigador Trasplante / OtsukaNew.</p>
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ficoll-Hypaque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440-02 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Hepes 1M | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine 200mM | Invitrogen | 25030-081 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
| Human AB serum (heat inactivated) | Gemini Bio-Products | 100-512 | Use validated batches |
| Complete Culture Media (500ml) | 440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin | ||
| Irradiator | GammaCell 1000 | ||
| T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps | Corning, Inc. | 3056 | |
| Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies | See protocol text | ||
| U bottomed 96 well culture plates | BD Labware | 353077 | |
| Monoclonal CD3 antibody | Beckman Coulter | IM0178 | Reconstitute with 200ml distilled water |
| Monoclonal CD28 antibody | Beckman Coulter | IM1376 | Reconstitute with 200ml distilled water |
| CMV grade 2 antigen | Microbix | EL-01-02 | |
| Tritiated Thymidine | NEN | NET027 | |
| Scintillation Fluid | PerkinElmer, Inc. | 1205-440 | |
| Harvester | Tomtec | ||
| Printed Filtermat A | PerkinElmer, Inc. | 1450-421 | |
| Filter Bag | PerkinElmer, Inc. | 1450-432 | |
| 1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter | Wallac |
References
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Alloantigen-specific AnergyInductionHuman Peripheral Blood Mononuclear CellsAlloantigen StimulationCo-stimulatory Signal BlockadeAllogeneic Hematopoietic Stem Cell TransplantationGraft-versus-Host DiseaseAHSCTDonor T CellsTransplantationImmune ReconstitutionRelapse PreventionNon-specific DepletionPharmacological ImmunosuppressionAllodepletion StrategiesRecipient Antigen Presenting CellsAllodepletion TechniquesOff-target EffectsInactivation
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Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade. J. Vis. Exp. (49), e2673, doi:10.3791/2673 (2011).