Fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei Neuron Soma e assoni

Parte 1: Preparazione del dispositivo a microfluidi neurone A 3 "wafer di silicio con un modello fatto di SU-8 di fotolitografia è utilizzata per lanciare l'(PDMS) Polidimetilsilossano stampo microfluidica. Ci riferiamo al SU-8 wafer di silicio modellata come stampi master o" maestri ". PDMS è mescolato con catalizzatore nel p / w rapporto di 10:1, cioè per 10 grammi di PDMS, 1 grammo di catalizzatore è aggiunto ad esso. Il PDMS è poi mescolato bene e versato sul wafer di silicio. Il wafer di silicio è contenuto in un piatto di polistirolo 10 centimetri di Petri. Ci vogliono circa 12 g per 15 g di PDMS per coprire il master con uno spessore di circa 4 mm. Il master con il PDMS viene poi posto in un essiccatore a vuoto con il coperchio della scatola di Petri, e pompa a vuoto. Questo viene fatto per aiutare a rimuovere le bolle d'aria dal PDMS che sono state introdotte durante l'agitazione in del catalizzatore. Ci vogliono circa 15 minuti per le bolle d'aria da rimuovere. Il master con PDMS viene rimosso dal essiccatore. Un fucile ad aria con un filtro da 0,45 um viene utilizzato per rimuovere eventuali bolle rimanenti. Il master è quindi posto su una piastra di 80 ° C a caldo per 1 ora da curare. Nota: se un essiccatore a vuoto non è disponibile, il master può essere lasciato a temperatura ambiente per diverse ore. Le bolle d'aria alla fine dissipare per conto proprio. Se un piatto caldo non è disponibile, il PDMS curerà a temperatura ambiente dopo 24 ore. Nota: E 'anche importante assicurarsi che il master sia in piano durante il processo di polimerizzazione. Parte 2: Taglio del dispositivo neurone microfluidi Una volta che il PDMS è curata sul master, che viene portato in una cappa pulita. Utilizzando una lama chirurgica, un cerchio è tagliato intorno al perimetro dei dispositivi. Quando si inserisce la lama nel PDMS, è importante prendere contatto con il wafer di silicio, ma non mettere troppa pressione sul wafer, altrimenti il ​​padrone si spezzerà. Con un cerchio tagliare tutto il modo per aggirare i dispositivi (ci sono 4 dispositivi per ogni "3 Master Silicio), il PDMS è alzato attentamente fuori il padrone. Questo può essere avviato da torcere delicatamente la lama chirurgica in quanto è inserito nel sezionate prima . Successivamente, i serbatoi sono forati nel dispositivo utilizzando un 8 mm biopsia punch. I dispositivi sono poi squartato e tagliato via l'eccesso PDMS in modo che il dispositivo si adatta perfettamente a Corning coperchio di vetro (n. 1) 24 mm x 40 mm. L'azoto dell'aria è usato per soffiare via tutti i detriti in eccesso. Detriti testardo può anche essere rimosso utilizzando Marca 3M Scotch 471 nastro in vinile. Parte 3: Plasma incollaggio i dispositivi scivola copertura in vetro. Cleaner plasma viene utilizzato per legare un Harrick i dispositivi neurone al coprioggetto. In breve, i dispositivi vengono inseriti nella pulizia al plasma e una pompa da vuoto è utilizzato per evacuare l'aria dalla camera. Dopo la pressione di vuoto ha raggiunto 300 milliTorr, si accende la bobina elettrica e impostato su alto. La bobina elettrica crea plasma ", un gas parzialmente ionizzato costituito da elettroni, gli ioni e atomi neutri o molecole" – http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , fuori le molecole di aria residua nella camera di sinistra. Il plasma crea specie reattive sulle superfici del vetro e del dispositivo, che una volta messi insieme formeranno un legame permanente. Il plasma si trasforma anche le superfici idrofile, che aiuta a facilitare l'aggiunta di liquidi. Inoltre, il dispositivo di pulizia al plasma sterilizza i dispositivi. La superficie del dispositivo PDMS che contiene il dispositivo a microfluidi è posizionato rivolto verso il filtro al plasma con le diapositive di vetro. Le superfici trattate al plasma del vetro e dispositivo a microfluidi sono assemblati in contatto con l'altro in un banco pulito, poi messo in sterili 60 piatti mm. Le superfici trattate formare un legame stretto irreversibile. Entro 10 minuti di plasma incollaggio dei dispositivi al vetro, Poli-L-lisina (PLL) viene aggiunto al dispositivo. Dopo 10 minuti, l'idrofilia del dispositivo diminuisce rendendo difficile per il PLL per entrare nel dispositivo. Nota: è importante verificare la presenza di bolle d'aria nel dispositivo dopo l'aggiunta di PLL. Le bolle d'aria nel canale principale sono indesiderabili, come farebbero ossidare le cellule. Un metodo semplice per rimuovere eventuali bolle d'aria esistente è quello di utilizzare una pipetta P200 riempito con 150 ul di liquido (in questo caso PLL), posizionare la punta direttamente all'apertura del canale principale, e premere il P200 con forza. Questo può essere necessario ripetere più volte ma alla fine la forza dalla pipetta guiderà le bolle fuori. I dispositivi contenenti PLL sono autorizzati a incubare una notte in una cultura incubatore standard di tessuto a 37 ° C con 5% di CO 2. Il giorno successivo, devizi sono sciacquate due volte rapidamente con autoclave dH2O. Durante questo processo, il liquido non è mai completamente rimossa dai canali principali, solo dai serbatoi. La rimozione di liquido dai canali principali introdurrà bolle. Dopo 2 risciacqui veloci, i dispositivi sono pieni di autoclave dH2O e reinserito nella incubatore per un minimo di 3 ore, o durante la notte. Il giorno dopo, i dispositivi sono ancora una volta risciacquati 2 volte rapidamente con autoclave dH2O. Poi, neurali dei media basale, contenente le integrazioni necessarie B27 e glutamax per i neuroni di ratto coltura principale, si aggiunge ai dispositivi. I dispositivi sono rimesse in incubatrice per un uso futuro. I dispositivi sono ora pronti per la semina dei neuroni.