Fabricage van een microfluïdische apparaat voor de compartimentering van Neuron Soma en axonen

Deel 1: Het voorbereiden van de microfluïdische neuron apparaat Een 3 "silicium wafer met een patroon gemaakt van SU-8 door fotolithografie wordt gebruikt om de Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische mal gegoten. We verwijzen naar de SU-8 patronen silicium wafer als meester mallen, of" meesters ". PDMS wordt gemengd met verharder in de aw / w-verhouding van 10:1, dat wil zeggen, voor 10 gram PDMS, is 1 gram verharder toegevoegd. Het PDMS is vervolgens goed gemengd en uitgegoten op het silicium wafer. De silicium wafer is vervat in een 10 cm polystyreen petrischaal. Het duurt ongeveer 12 g tot 15 g van PDMS aan de master te bedekken met een dikte van ongeveer 4 mm. De meester met het PDMS wordt dan geplaatst in een vacuüm exsiccator met het deksel van de petrischaal, en vacuüm wordt toegepast. Dit wordt gedaan om te helpen luchtbellen te verwijderen uit de PDMS die werden geïntroduceerd tijdens het roeren in de verharder. Het duurt ongeveer 15 minuten voor de luchtbellen worden verwijderd. De master met PDMS wordt verwijderd uit de exsiccator. Een lucht pistool met een 0,45 um filter wordt gebruikt om de resterende luchtbellen te verwijderen. De master wordt dan geplaatst op een 80 ° C hete plaat gedurende 1 uur om uit te harden. Opmerking: Als een vacuüm exsiccator niet beschikbaar is, de meester kan worden achtergelaten bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. De luchtbellen zullen uiteindelijk verdwijnen op hun eigen. Als een hete plaat is niet beschikbaar is, zal het PDMS uitharden bij kamertemperatuur na 24 uur. Opmerking: Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de master-niveau is tijdens het uithardingsproces. Deel 2: Knip uit het neuron microfluïdische apparaat Zodra de PDMS is uitgehard op de master, is het naar een schoon kap. Met behulp van een chirurgisch mes, is een cirkel gesneden rond de omtrek van de apparaten. Wanneer men voegt het blad in het PDMS, is het belangrijk om contact te maken met de silicium wafer, maar om niet te veel druk op de wafer, anders wordt de meester zal barsten. Met een cirkel knippen helemaal rond de apparaten (er zijn 4 apparaten per elke 3 "Silicon Master), is het PDMS voorzichtig getild de meester. Dit kan worden gestart door voorzichtig te draaien de chirurgische mes zoals het is ingevoegd in de voorafgaande cut . Vervolgens worden reservoirs gestanst in het apparaat met behulp van een 8 mm weefsel biopsie punch. De apparaten worden dan in vieren en het teveel PDMS getrimd weg, zodat het toestel netjes past op Corning Glass Cover (nr. 1) 24 mm x 40 mm. Stikstof lucht wordt gebruikt om de klap weg overtollige vuil. Hardnekkige vuil kan ook worden verwijderd met 3M Scotch Brand 471 vinyl tape. Deel 3: Plasma hechting de apparaten om glas dekglaasjes. Plasma Cleaner wordt gebruikt om de band A Harrick het neuron apparaten aan op de dekglaasjes. Kortom, zijn de apparaten geplaatst in het plasma schoner en een vacuümpomp wordt gebruikt om de lucht te evacueren uit de kamer. Nadat de vacuümdruk heeft bereikt 300 millitorr, is macht ingeschakeld om de elektrische spoel en ingesteld op hoog. De elektrische spoel creëert plasma, "een gedeeltelijk geïoniseerd gas dat bestaat uit elektronen, ionen en neutrale atomen of moleculen" – http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , uit de resterende luchtmoleculen links in de kamer. De plasma creëert reactieve stoffen op het oppervlak van het glas en het apparaat, dat wanneer ze samen geplaatst zal een blijvende band te vormen. De plasma wordt ook het oppervlak hydrofiel, die helpt vergemakkelijken de toevoeging van vloeistoffen. Daarnaast is de plasma reiniger steriliseert de apparaten. Het oppervlak van de PDMS apparaat dat de microfluïdische apparaat bevat is geplaatst zijde naar boven in het plasma reiniger, samen met het glas dia's. De plasma behandelde oppervlakken van het glas en microfluïdische apparaat worden gemonteerd in contact met elkaar op een schone bench, dan geplaatst in steriele 60 mm gerechten. De behandelde oppervlakken vormen een hechte band onomkeerbaar. Binnen 10 minuten van plasma hechten van de apparaten op glas, is Poly-L-lysine (PLL) toegevoegd aan het apparaat. Na 10 minuten zal de hydrofiliciteit van het toestel afnemen waardoor het moeilijk is voor de PLL om het apparaat in te voeren. Opmerking: Het is belangrijk om voor de luchtbellen in het apparaat te controleren na de toevoeging van de PLL. Luchtbellen in het hoofdkanaal zijn ongewenst, omdat ze zouden oxideren cellen. Een eenvoudige methode om bestaande luchtbellen te verwijderen is het gebruik van een P200 pipet gevuld met 150 ul van de vloeistof (in dit geval PLL), direct plaats de tip bij de opening van de belangrijkste kanaal, en krachtig druk de P200. Dit moet mogelijk worden meerdere malen herhaald, maar uiteindelijk de kracht van de pipet rijdt de luchtbellen uit. De apparaten met PLL mogen 's nachts in een standaard weefselkweek incubator geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO 2. De volgende dag, de deondeugden zijn tweemaal snel gespoeld met geautoclaveerd dH2O. Tijdens dit proces wordt vloeibare nooit helemaal verwijderd van de belangrijkste kanalen, alleen van de reservoirs. Het verwijderen van vloeistof uit de belangrijkste kanalen zal introduceren bubbels. Na twee snelle spoelingen, zijn de apparaten gevuld met geautoclaveerd dH2O en terug geplaatst in de incubator voor een minimum van 3 uur, of 's nachts. De volgende dag, zijn de apparaten opnieuw twee keer snel gespoeld met geautoclaveerd dH2O. Vervolgens wordt neurale basale media, met de nodige aanvullingen B27 en Glutamax voor het kweken van primaire rat neuronen, toegevoegd aan de apparaten. De apparaten zijn terug geplaatst in de incubator voor toekomstig gebruik. De apparaten zijn nu klaar voor het zaaien van neuronen.