Ortotópico do xeno-Human-luciferase Tagged maligna dos nervos periféricos Células Tumorais Bainha para In vivo Teste de Agentes Terapêuticos candidatos

1. Preparação inicial de não-nu camundongos imunodeficientes (não é necessário para Cepas Nudez): Todos os procedimentos foram revistos e aprovados previamente pelo Animal Care UAB Institucional e Comitê de Uso e conduzido por pessoal devidamente treinado. Temos utilizado com sucesso três linhagens de camundongos imunodeficientes para estas experiências: a Foxchase) outbred camundongos SCID (CB17/lcr- Prkdc scid / lcrCrl ratos); b) NIH III camundongos (NIHS-Lyst bg Foxn1 nu camundongos Brk xid), e c ) NOD-SCIDγ camundongos (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ ratos). Em nossas mãos, o crescimento de xenoenxertos ortotópico é praticamente idêntico no NIH III e NOD-SCIDγ ratos, os quais carregam mutações que afetam a função das células T, células B e células NK; para este protocolo, o número de dias necessários para o enxerto crescimento, o momento em que a terapia é iniciada e os tempos pós-enxerto, quando é realizada de imagem são os que temos empiricamente determinada usando NOD SCIDγ-ratos. Crescimento do enxerto em camundongos SCID Foxchase outbred, que têm defeitos de T e função de células B, normalmente leva mais tempo. Para facilitar a enxertia de um grande número de não-nu camundongos imunodeficientes, nós remover pêlos de sítio cirúrgico na tarde anterior à enxertia. Os ratos são anestesiados utilizando uma câmara de indução isoflurano anexado a um vaporizador com scavenge para o gás residual. Para manter a temperatura corporal, os animais são tratados em uma almofada de aquecimento em todo este processo. Clippers são usados ​​para remover os pêlos do baixo meados de volta para o joelho da perna do lado que está a ser enxertada. Qualquer cabelo restante é cuidadosamente removido do site em ~ 5 minutos usando um agente químico depilatórios (por exemplo, Nair, em um determinado produto com aloe vera para a pele sensível). Remoção do produto depilatório é recomendado, pois pode levar a irritação da pele, olhos e superfícies outro organismo ao qual ele pode se espalhar. Nós não enxerto de ambos os nervos ciático nesses experimentos, pois isso pode prejudicar a função hindleg bilateralmente, resultando na perda de ratos dos grupos de estudo. Ratos têm permissão para se recuperar totalmente de uma almofada de aquecimento em uma gaiola isolada, sem cama, o que garante que tanto os ratos não são feridos por outros, mais animais totalmente alerta e impede que eles acidentalmente inalar cama. Quando os ratos são totalmente móveis e não mostram evidência de grogginess, podem ser reintroduzidos em uma gaiola com outros ratos. 2. Preparação de células MPNST para injeção no Dia da Enxertia Neste protocolo, os números específicos de células enxertadas e os tempos necessários para o crescimento do tumor pós-enxertos são aqueles que temos empiricamente determinado para ST88-14 células, uma linha comumente usado MPNST que foi derivada de um tumor NF1 associados 5. As células que nós usamos para enxerto foram transduzidas com um vetor lentiviral contendo um cassete de CMV-luciferase-IRES-puromicina e clones expressando estavelmente firefly luciferase identificado por bioluminescência imagem 6. Temos também realizou experimentos com enxertos de células transfectadas estavelmente MPNST com plasmídeos expressando firefly luciferase sob o controle do promotor CMV imediata cedo. Nós não recomendamos essa que temos encontrado que estes vetores plasmídeo são propensas a sofrer extinção da seguinte expressão enxertia. ST88-14 células são cultivadas em meio mínimo Dulbecco é essencial suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 estreptomicina mcg / mL e 10 UI / mL penicilina (DMEM10), 5 puromicina mcg / ml também está incluído para manter a seleção para o vetor lentiviral. Temos mantido essas células em nosso laboratório por 50 passagens e não observaram qualquer variação no crescimento celular em qualquer destas passagens. 9 x 10 5 células ST88-14 são banhados em um frasco T175 e cresceu durante 3 dias, altura em que o frasco é de aproximadamente 80% confluentes. Para enxerto 35 ratos, um único frasco de 80% T175 confluentes é necessária; nesta densidade, o nosso rendimento médio da ST88-14 células é de 7,3 x 10 6 células por T175 frasco. É extremamente importante que as células não ser permitido a crescer a confluência antes da colheita para enxertia. Nós descobrimos que as células do miocárdio a partir dos resultados colhidos em frascos confluentes um maior grau de falência do enxerto e, muitas vezes prolonga o curso vivo no de crescimento do enxerto. ST88-14 células são lavadas uma vez com a solução à temperatura ambiente Hanks salina balanceada. As células são retiradas do frasco usando celular Stripper célula dissociação solução por 30 segundos a 1 minuto à temperatura ambiente. Cinco mililitros de DMEM10 (Nota: puromicina não está incluído neste meio) por cada mililitro de Stripper célula utilizados são então adicionados às células. As células são contadas usando um hemocitômetro. 5 x 10 3 células ST88-14 em suspensão em 3 mL será injetado por mouse. A quantidade de células suficientes para enxerto de toda a coorte, com subsídio para pipetagemerro (por exemplo, por 35 ratos, que normalmente transferir um número de células suficientes para enxerto de 40 ratos), é transferido para um tubo estéril 1,5 mL. As células são centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante é cuidadosamente removido eo pellet celular ressuspenso em DMEM10 (Nota: puromicina não está incluído neste meio) para uma concentração final de 5 x 10 3 células por 3 mL. Manter as células no gelo. 3. Enxerto Protocolo Os ratos são anestesiados na câmara de indução de um vaporizador de isoflurano até que já não retirar o seu membro posterior a um estímulo pitada dedo do pé. Os ratos são colocados do lado deles e administrado por via subcutânea com 0,05 mg / kg de buprenorfina hydrocholoride. A anestesia é então mantida pela administração contínua de isoflurano entregues via nariz cone. Por favor, note que uma camundongos sacrificados foi usado para demonstrar este procedimento para o vídeo e, conseqüentemente, a tubulação isoflurano usado para entregar o isoflurano não é visível no vídeo. Para manter a temperatura corporal, os animais são tratados em uma almofada de aquecimento durante todo o processo de enxertia. Para evitar ressecamento da córnea, uma pequena gota de pomada oftálmica (Puralube pomada veterinária) é administrado para cada olho. Como será necessário para cada rato para ser identificado exclusivamente durante o julgamento, uma marca auricular com um número identificador único é cortado para a orelha direita de cada rato. Coloque o animal no estômago, espalhando patas traseiras. Cobrir o mouse com uma cortina estéreis, expondo a janela cirúrgica (flanco), onde irá ocorrer de enxertia. A cortina estéreis devem permitir a visualização da cabeça, tanto para garantir que o nariz ainda está dentro do cone e para permitir o monitoramento da respiração e da cor do animal. Aplicar betadine para o local da cirurgia com um aplicador derrubado algodão, começando no centro do flanco e, gradualmente, em espiral para fora, para as bordas da janela cirúrgica. Etanol 70% é então aplicado ao local da cirurgia da mesma maneira. Aplicações consecutivas de betadine seguido pelo etanol são repetidas mais duas vezes. Remove as células de gelo e quer gentilmente vórtice ou apertar o tubo para ressuspender as células resolvido. Com uma pipeta, 3,2 mL remover da suspensão de células e ejetá-lo sobre um pedaço de Parafilm. Ao remover mais do que o necessário e colocar a suspensão na Parafilm, podemos assegurar que não há bolhas na suspensão e que temos uma mL 3 cheio para a injecção. Puxe o máximo da suspensão de células possível para uma seringa Hamilton de 10 L equipada com uma agulha de calibre 33. Flick bolhas da seringa e expelir o excesso de suspensão de células a exatamente mL 3. Segure as células ea seringa contendo células em gelo até estar pronto para uso; para garantir que a agulha permanece estéril, não permitem o contato com o gelo ou o balde. Um pedaço de saran wrap pode ser colocado em cima do gelo para a seringa diretamente em contato com o gelo. Usando um No. 4 lidar com bisturi equipado com um 22 º lâmina de bisturi, fazer uma incisão através da pele do flanco logo abaixo e paralelo ao fêmur, certifique-se que a incisão não se estende além dos limites do campo cirúrgico limpo. Abrir a incisão na pele com uma pinça cirúrgica ou manualmente para expor o músculo subjacente. Um avião fascial será visível em execução ao longo do comprimento da perna, o nervo ciático se encontra abaixo deste e entre os dois músculos ligados pela fáscia. Usando um par de tesouras de ponta aguçada, sem corte dissecar através deste fascia para expor o nervo ciático, que deve ser aparente como uma estrutura linear branco sobre a espessura de um fio grosso. Usando um par de pinças de ponta aguçada curvas, dissecar cuidadosamente sob o nervo, liberando-a do músculo subjacente, o que eleva tanto e isola o nervo. Deixe o fórceps sob a coragem de manter esta posição. Insira cuidadosamente a agulha da seringa Hamilton no nervo, tentando manter o ângulo de injeção como paralelo com o nervo possível para que a agulha não perfure através da parte inferior do nervo. A agulha deve ser inserida no final do nervo distal à espinha-descobrimos que a injeção de células tumorais no nervo em direção à medula espinhal estabelece as células do tumor enxertados em estreita proximidade com a medula espinhal. Quando isso ocorre, as células do tumor, muitas vezes invadem a medula espinhal, resultando em perda prematura do animal a partir do grupo de estudo devido ao comprometimento da função da medula espinhal. Uma vez que a agulha esteja posicionada corretamente no nervo, relaxar a tensão produzida no nervo do fórceps e injectar lentamente as células da seringa para o nervo mais de 45-60 segundos. É essencial que isso seja feito devagar, tão rapidamente a expulsão do conteúdo da seringa irá resultar em um "back wash-" das células tumorais ao redor do local da injeção e sua perda. Depois de todas as células foram injetadas com sucesso, retirar a agulha lentamente para minimizar a perda do material injetado. Para remover oceps e coloque cuidadosamente nervosas de volta para sua posição original sob o músculo. Feche a incisão cirúrgica com cola cirúrgica Vetbond. Segure incisão junto com uma pinça por aproximadamente 20 segundos para permitir que a cola secar. O mouse é removido do isoflurano nariz cone e colocado sozinho em uma gaiola cama livre para se recuperar. Esta gaiola deve ser mantido no topo de uma almofada de aquecimento até que o animal esteja completamente recuperado. Parte da gaiola de recuperação não deve ser sobre uma almofada de aquecimento, isto permite que o animal a afastar-se do calor, se ficar muito quente. Após enxertia, os animais devem ser avaliados regularmente para mastigar no local, claudicação ou anorexia; estes sinais podem indicar que o animal ainda está em dor e analgésicos que apropriado deve ser dado. Depois de ganhar experiência com este procedimento, descobrimos que os ratos 30-40 pode ser facilmente enxertados em um único dia. 4. Avaliação do sucesso do enxerto e randomização em grupos de estudo Imagem de bioluminescência é utilizado para avaliar o sucesso do processo de enxertia. Usamos um sistema de IVIS-100 (originalmente de Xenogen, que agora é conhecido como Calipers Inc.) para detectar a emissão de luz de tumor expressos luciferase do firefly que é produzido como resultado da reação química de luciferase com seu substrato, D-Luciferina . As análises destas imagens específicas determinar se os ratos enxertados são adequados para a entrada no coortes ensaio terapêutico. Em experimentos preliminares, temos quantificados os sinais de bioluminescência detectável, sacrificaram ratos enxertados, colhidos seus tumores e correlacionados pesos tumor com os sinais de bioluminescência de região de análises interesse usando o fabricante do Software imagem viva. Estes estudos demonstraram que havia uma correlação linear entre o peso do tumor e enxerto de emissão de luz bioluminescência, indicando que a imagem de bioluminescência é um meio adequado substituto de avaliar o crescimento xenoenxerto durante todo o curso de ensaios pré-clínicos. Tipicamente imagem que cinco camundongos, ao mesmo tempo. Detalhes adicionais sobre imagem de bioluminescência foram publicados anteriormente 7. Para avaliar o sucesso do enxerto, a imagem de bioluminescência é realizada 1 e 3 dias de pós-enxertia. As imagens são coletadas de ratos orientado na mesma posição 10 min após a injeção intraperitoneal de 2,5 mg D-Luciferina. Durante a gravação, os ratos são mantidos sob anestesia com isoflurano e sua temperatura corporal mantida a 37 ° C por uma almofada de aquecimento presente no imager Xenogen. Tempos de aquisição de imagem estão na faixa de 2 segundos a 10 minutos, o software de aquisição de dados assegura que nenhum pixel estão saturados durante a coleta de imagem. Emissão de luz das regiões tumor (contagens de fótons relativa / sec) é medida usando software proprietário de Xenogen. Intensidade de emissão de luz é representada por escalar pseudo da bioluminescência, que é sobreposto em fotografias em preto e branco dos ratos que são coletados ao mesmo tempo. Para ser elegível para inclusão em uma coorte experimental pré-clínico, os ratos devem ter um sinal de bioluminescência detectável tanto 1 e 3 dias pós-enxerto e da intensidade do sinal de bioluminescência deve aumentar entre os dias 1 e 3. Animais que tenham um sinal de diminuição ou estáticos são excluídos. Além disso, os sinais detectados em ratos enxertados no mesmo dia deve estar dentro de uma ordem de grandeza de cada um; camundongos com sinais de bioluminescência que são uma ordem de magnitude maior ou menor do que os detectados em animais enxertados no mesmo dia também são excluídos. Uma vez que os ratos foram identificados que atendem a esses critérios, eles devem ser divididos aleatoriamente em grupos de tratamento. Para alcançar este objectivo, os sinais de luciferase detectado em ratos enxertados três dias pós-enxerto são primeiro ordenado maior para o menor intensidade. Ratos são, então, randomizados em grupos, atribuindo-lhes, por ordem de intensidade para os grupos de tratamento, revertendo essa ordem e, em seguida, repetindo o processo até que todos os ratos são atribuídos a grupos. Por exemplo, se existem 4 grupos de tratamento (por exemplo, placebo, e três concentrações de droga teste) ratos são atribuídos aos grupos na ordem 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 , 4, 4, 3, 2, 1 .. etc Antes de iniciar o tratamento, os sinais de bioluminescência detectadas em cada membro do grupo atribuídas são em média para se certificar de que os sinais média de partida dentro de todos os grupos são o mais próximo possível. Administração do agente terapêutico é candidato começou no dia 3. Para avaliar o efeito do agente terapêutico tem sobre o crescimento do enxerto durante o curso do tratamento, a imagem latente da bioluminescência é realizada uma vez por semana após o início da terapia (dias 10, 17, 24, 30 pós-enxertia). Para não-nu camundongos imunodeficientes, é extremamente importante que os animais novamente ter crescimento de pele nova removido com Nair antes de executar cada sessão de imagem. Isso é porque o cabelo blocos sinais bioluminescentes, com a cor da pelagem determinar o quanto do sinal é perdido. Por exemplo, a pele branca, como é encontrado na Suíça Webster ratos produz uma redução de 18% na intensidade do sinal bioluminescente 8, enquanto a pele preta pode diminuir os sinais em até 10 vezes 9. Gostaríamos também de notar que não se pode presumir que regrowth pele uniforme vai ocorrer em todos os grupos de tratamento e "normalizar" as reduções de sinal entre os grupos de tratamento. Isso ocorre porque o agente terapêutico em si pode afetar o crescimento do cabelo. Por exemplo, temos observado que o tratamento com tamoxifeno inibe crescimento do cabelo, minimizando assim o efeito percebido desse agente no crescimento do tumor quando comparado ao placebo camundongos tratados. Com células ST88-14 MPNST, os camundongos podem ser realizadas por 30 dias pós-enxerto. Neste momento, os tumores geralmente têm crescido ao tamanho máximo permitido pelo cuidado animal institucional e comitês de uso e deve ser sacrificado. Após a sessão de imagem final, os ratos são mortos e amostras necessárias para análise dos resultados do tratamento (por exemplo, de sangue para determinação dos níveis circulantes do agente terapêutico, o tecido tumoral para determinação do peso, o exame de histologia, determinação de índices de Ki67 e rotulagem TUNEL e avaliação dos parâmetros bioquímicos) coletados. Precisamente o que as amostras são coletadas dependerá das necessidades do projeto experimental. Camundongos com tumores devem ser monitorados diariamente e terminou se eles ficam doentes (aliciamento falta normal e comportamentos de evitação), são incapazes de comer ou beber, ou se o tumor se torna excessivamente grande de dificultar o movimento do corpo normal. Carga tumoral não deve ser permitido exceder 10% do peso corporal do animal normal. Peso do tumor em percentagem do peso corporal é calculado através da comparação do peso dos animais com tumor ao peso da idade / sexo animais controle pareado. Caquexia não deve ser permitida a tornar-se clinicamente significativo. Perda de peso em animais portadores de tumor não deve exceder 20% do peso corporal normal. 5. Resultados representativos: A figura 1 ilustra o aumento progressiva usual bioluminescência observada 1 a 18 dias pós-enxerto em um xenoenxerto devidamente estabelecidos ortotópico em um nu (NIH III) mouse (AC). Quantificação dos sinais de bioluminescência observada 1-24 dias após a enxertia mostra que, embora estes sinais aumentam progressivamente, o crescimento do tumor acelera acentuadamente nos últimos estágios do período de estudo (Figura 1D). Rigorosamente demonstrar que o crescimento do tumor ocorreu em camundongos enxertadas, que recolhem o nervo ciático e, se se verificar que o tumor se rompeu epineuro e invadiu tecidos adjacentes, em torno dos tecidos moles e músculo esquelético. Dado o crescimento agressivo de MPNSTs, não é de estranhar que muitas vezes achamos que as células do tumor enxertados ter violado as barreiras normal do nervo e invadiu tecidos adjacentes (Figura 1E). Também muitas vezes achamos que as células enxertadas MPNST migrar agressivamente no nervo proximal e distal ao local do enxerto. Figura 1. Imagem de bioluminescência NIH III do mouse ortotopicamente enxertado com luciferase marcadas células MPNST um dia pós-enxerto (A). Note que os sinais detectados na região de interesse (ROI) em camundongos diferentes estão todos dentro de uma ordem de grandeza do outro. Recriação de 10 dias (B) e 18 dias (C) pós-enxerto mostra que os sinais bioluminescentes aumentar progressivamente no local do enxerto em camundongos individual. (D) Gráfico ilustrando o aumento progressivo do fóton em relação contagens / segundo detectados ao longo do local do enxerto 1-24 dias pós-enxerto. (E) Fotomicrografia do local do enxerto a partir deste rato demonstrando o crescimento do tumor e invasão focal em músculo esquelético adjacente.