ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

1. תא הכנה מתזמן על Micropatterns מקום 2 CYTOOchips ב 2 בארות עצמאית של צלחת 6 גם להבטיח כי אתה קורא "CYTOO" בפינה הימנית התחתונה של CYTOOchip. Micropatterns ניתן שכותרתו fluorescently עם Cy3 או Cy5 צבעים. CYTOOChips השתמשו לצורך הניסוי הזה יש Cy3 שכותרתו fluorescently micropatterns. זהירות: שמור שבבי בחושך. איסוף תאים הלה (~ ומחוברות 80%) על ידי trypsinization. בדוק תחת מיקרוסקופ כי תאים מפוזרים כראוי על ידי הטיפול טריפסין. איסוף צנטריפוגות תאים ב 300 גרם במשך 4 דקות, אז בעדינות resuspend התא גלולה. ספירת תאים ו לדלל את ריכוז של 15,000 תאים / מ"ל ​​השלימה התקשורת DMEM/F12 תרבות. לוותר על 4 מ"ל (60,000 תאים) לתוך כל טוב המכיל CYTOOchip. זהירות: צלחת יש להעביר מעט ככל האפשר כדי למנוע גרימת כל תנועות סיבוב במדיום כמו זה יהיה נוטים להתרכז תאים במרכז. תן משקעים תאים עבור 10 דקות מתחת למכסה המנוע ואז להעביר אותם לתא האינקובטור. לאחר 10-20 דקות, התאים יתחילו לדבוק micropatterns. לאחר 10 דקות, לבדוק באופן קבוע מתחת למיקרוסקופ. ברגע התאים מחוברים, שנה את בינונית התא בעדינות ולשטוף את פני השטח coverslip באמצעות ההליך הבא: שמירה על צלחת שטוחה, בעדינות לשאוב את המדיום עם טפטפת מן הצד של הבאר. זהירות: לא לתת את יבש שבב, זה אומר לא לשאוב את כל הנוזל, אך להשאיר מספיק כדי לכסות את CYTOOchip בכל עת. הוסף 4 מ"ל PBS ואת לשאוב שוב הראשון מתחיל במרכז השבב ואז זז לצד הבאר. לשאוב את PBS כמתואר בלי לחשוף את השבב לאוויר. חזור על 3-4 פעמים. בדוק מתחת למיקרוסקופ על תאים צפים: אם מספר גדול של תאים צפים להישאר, לחזור על התהליך כביסה. אם אתה רואה מעט מאוד תאים, לשאוב את חלק PBS ולהחליף אותו בינוני מ"ל 2 טריים. לשאוב ולהוסיף 4 מ"ל של מדיום טרי פעמיים. מניחים את הצלחת תרבות רקמות החממה ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך תקופה מינימלית של שלוש שעות, כדי לאפשר לתאים כדי להשיג מלא מתפשטת. הערה: באמצעות שיטה זו בין% 10-30 (2000-6500) micropatterns יהיה תפוס על ידי תאים בודדים או מרובים. זהירות: הזמן הדרוש תאים לדבוק לפני שלב הכביסה ואת הזמן הדרוש מלא התפשטות תאים micropatterns יהיה ספציפי כל שורה התא. 2. Blebbistatin טיפול ממיסים את blebbistatin ב DMSO 100% כדי להשיג פתרון המניות של mM 17. פתרון לדלל את מניות נוספות 5 מ"מ עם DMSO 100%. ביצוע הדילול הסופי בינוני תרבות להשיג הריכוז הסופי של blebbistatin 5 מיקרומטר DMSO 0.1%. התנאים לקבלת שליטה, להכין 4 מ"ל של מדיום המכילה DMSO 0.1% בלבד. לשאוב את התקשורת על תאים ולהחליף אותו בינוני 4 מ"ל מוכן התנאים טיפול ובקרה. תאים דגירה עבור 1 שעות בשעה 37 ° C. 3. קיבוע נייד ו מכתים של אקטין פתרון לקראת קיבוע התא אנא ראה סעיף מגיב להכנת cytoskeleton חיץ (CB) ו PFA 5%. CB מומלץ במיוחד עבור תיוג הקרינה של סיבי אקטין ו microtubules. הכן 1xCB-סוכרוז: להוסיף 1 גרם של סוכרוז על 2 מ"ל של CB. הכללה של סוכרוז עוזר לשמר מבנים תאיים פנימיים. הכן 4% PFA-CB-סוכרוז: הוסף 1 מ"ל של סוכרוז-1xCB כדי מ"ל של 4% חם 5 PFA. זהירות: זה הפתרון יכול להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים בלבד. PFA קיבעון שימוש במלקחיים כדי להרים את CYTOOchip על הלוגו CYTOO ולמקם אותו (בלי כביסה) בבאר צלחת 6-היטב המכיל 2 מ"ל של תמיסת PFA-CB-סוכרוז 4% דגירה 10 דקות ב RT הסר PFA-CB-סוכרוז ולשטוף פעם עם PBS האם לשטוף השני עם 2 של 100 מ"ל NH Cl 4 מ"מ עבור 10 דקות על מנת להרוות שיורית פעילות PFA crosslinking הערה: שקופיות PFA קבוע ניתן לאחסן PBS במשך כמה ימים ב -4 מעלות צלזיוס לפני מכתים אברון עבור דימות פלואורסצנטי. Permeabilization של קרום התא עם טריטון X-100 Permeabilization של תאים עם חומר ניקוי מאפשר נוגדנים או בדיקות אחרות כדי לחדור את קרום התא מבטל חלק הבריכה cytosolic של חלבונים cytoskeleton כי אחרת יכול להפחית את הניגוד של פולימרים cytoskeletal ולכן קשה לנתח לוקליזציה שלהן. הסר NH 4 Cl ומוסיפים 2 מ"ל / גם של 0.1% Triton X-100-CB דקות 3 ב RT שטפו פעמיים עם 2 מ"ל PBS אקטין מכתים פלורסנט-phalloidin אשר נקשר אקטין יליד רק משמש כתם אקטין filaments. הוסף 2 מ"ל של phalloidin FITC-מצומדות בדילול 1:2000 ב-PBS עם BSA 1.5% דגירה 1 ש 'ב RT לשטוף פעם אחת עם 2 מ"ל PBS גרעינים מכתים הוסף 2 מ"ל של Hoechst (כתם עם 1μg / מ"ל ​​PBS) דגירה 3 דקות ב RT לשטוף 2 פעמים עם 2 מ"ל PBS הרכבה של השקופית תרימי את CYTOOchips על הלוגו CYTOO ו CYTOOchip הר לשקופית באמצעות מיקרוסקופ רגיל 25-30 μL של Mowiol או כל פתרון הרכבה אחרים. 4. מיקרוסקופ התקנה רכישת תמונה אוטומטי מספר רב של חבילות תוכנה הדמיה קיימות השולטים מיקרוסקופ לרכישת מהר תמונה להציג אוטומטיות. דוגמה זו משתמשת Metamorph תוכנת הדמיה ורכישות אוטומטי מבוצעות על מיקרוסקופ Eclipse טי Nikon מצויד במצלמת CCD Hamamatsu ואת המאייר כספית סיבים Intensilight. תמונות נרכשים בהגדלה 20x בשלושה אורכי גל המתאים DAPI (גרעינים), סי-3 (micropatterns) ו-FITC Phalloidin (אקטין). מספר micropatterns דמיינו לכל תחום ישתנו בהתאם המצלמה setups אובייקטיבי. Micropatterns CYTOO מוצבים במרווחים מוגדר אחד מהשני (100 או 130 מיקרומטר) על פני השבב מאוד להקל על הרכישה. בחר הגדלה 20x רכישת רב מימדי פתוח (בשורת התפריטים: Apps / רב מימדי רכישה) וכן להגדיר את הפרמטרים השונים של הניסוי: מספר אורכי גל: 3 אורך גל סוגים: DAPI, FITC, Cy3 קביעת זמן החשיפה הגל הראשון על ידי כל התמקדות בתחום של תאים מיקוד אוטומטי יכול להתבצע על כל גל בחר היכן לשמור את הנתונים בחר Cy3 הגל ואת המיקום את המצלמה כך 12 micropatterns הם דמיינו ו ממוקדת בתחום המצלמה (4 עמודות ו 3 שורות של תבניות). יצירת כתב העת לפעול רכישת רב ממדית. ההליך ליצירת העת מתואר באיור 1. פונקציה פתח הבמה סריקה (בשורת התפריטים: Devices / שלב / סריקה שלב). כדי לרכוש 24 תמונות שכל אחת מהן מכילה 12 micropatterns בהגדלה 20x, הזן 6 עמודות ו 4 שורות עם -400 מיקרומטר X גודל צעד Y 300 מיקרומטר גודל הצעד. ביומן להגדיר לבצע, להעלות את MDA.JNL העת. לאחר מכן לחצו על Scan כדי להתחיל את רכישת אוטומטית של בלוק שלם בשלושת אורכי גל. הערה: X ו-Y בגדלים צעד הצביעו פה ישתנה בהתאם למספר micropatterns להציג בשדה המצלמה. בהתאם לשלב את הגדרת הכיוון X ו / או Y עשוי לדרוש ערכים שליליים עבור תנועה בכיוון הנכון. 5. עיבוד תמונה ניתוח אוטומטי רבים עיבוד וניתוח תמונה חבילות תוכנה קיימות. ההליכים המתוארים להלן תמונה מתאר עיבוד צעדים ניתוח שבוצע על ידי 2 מחוייט מאקרו נכתב עבור התוכנית קוד פתוח ImageJ. CellRef first המאקרו יוצרת Cell Reference, את היתר אמצעים second קשיחות / קריסה של קרום התא. שניהם זמינים על פי דרישה באמצעות www.cytoo.com . יצירת ערימות תמונה עבור כל שלושת ערוצי התרכזו micropatterns (מאקרו CellRef). השימוש micropatterns נמנע תא אשכולות clumping, מפשטת מאוד את הצעד הראשון עיבוד תמונה אוטומטי אשר לוקליזציה פילוח של תאים בודדים. התמונות שכותרתו fluorescently micropattern משמשים להגדיר אזורים לתחום התרכזו micropatterns. אזורים אלה הם משורבב אז על התמונות רכשה בערוצים אחרים קצוץ. תמונות קצוץ מקבילים מורכבים אז בערימות עבור כל אורך גל. RGB מחסנית נוצר גם המיזוג של שלושת הערוצים (איור 2). החל יחיד מבחר תא מסנן (מאקרו CellRef) כפי שצוין לעיל, 10-30% (2000-6500) של micropatterns הם שנכבשו על ידי תא בודד או מספר תאים, בעוד micropatterns שנותרו ריקים. כדי לבחור תמונות להראות micropatterns שנכבשו על ידי תא אחד בלבד, במאקרו מזהה את המספר של גרעינים לכל תמונה ומונע מכל גרעין (RGB ו באורכי גל שונים) ערימות אלה יותר מפעם אחת המכילה או בלי גרעינים (איור 3). לחסל הלא מנורמל ותאי שלא נמתחים באופן מלא על פני שטח micropattern באמצעות ניתוק התא מסנן (מאקרו CellRef) כדי להסיר את חלוקת התאים היה נמלט לסנן גרעינים, אחר לסנן באמצעות ערוץ FITC עבור אקטין מוחל. שטח תא מחושב אלה להלן את חתך מסוים (אזורים התא על פי 2 פחות שטח התא שלבי הביניים) יוסרו מן המדפים את כל. שטח מעטפת התא נקבעת על ידי גודל של התבנית. יישור תמונות תא (מאקרו CellRef) מן השלבים הקודמים, תמונות המכיל micropat יחידתאים terned נבחרו. אף על פי התמונות הללו התרכזו micropatterns, הם מעולם לא כל מיושר לגמרי זה לזה. כדי לסיים את עיבוד תמונה, תוסף ImageJ (MultiStackReg) מוחל ליישר מחדש את כל התמונות שנאספו כל הערוצים המבוססת על המיקום micropattern. צעד זה יוצר ערימות מיושר של תמונות בודדות, כי כעת ניתן להשתמש לצורך ניתוח יצירת תא יחיד או של תא הפניה (איור 4) בניית תא הפניה (מאקרו CellRef) גידול תאים על micropatterns כלומר כל התאים יש צורות דומות. נורמליזציה זו מאפשרת התאמה מדויקת של כיסוי תא תמונות רבות. לסיכום אות בתמונה על כל מחסנית שלמה מאפשר לחזות ולמדוד "אפקט התרופה הממוצע". התמונה הכללית הסופית או נייד הוא כלי עזר ייחודי ושימושי עבור ייצוג וניתוח התמונה יכולה להיות מושגת רק עם תאים micropatterned (איור 4). ב ImageJ, תא הפניה נבנית על ידי ביצוע השלכה של התמונות מסונן בציר מתוך ערימה (תמונה> סטאקס> Z-הפרוייקט). שיטות ההקרנה כמה ניתן ליישם כגון עוצמת ממוצע או מקסימום אבל בדרך כלל השלכה חציון נבחר אשר מבטלת חריגים העיקרי של מחסנית התמונה. כדי להקל על בחינה של התוצאות, LUT (חפש טבלאות) להמיר את התמונה monocolor לתוך המפה בצבעים תדר מוחל. מדידה וכימות הפרמטרים של עניין (היתר מאקרו) במאמר זה וידאו, L-micropatterns משמשים בגלל בצורת מארגן את cytoskeleton אקטין לתוך סיב מתח אחד גדול. על ידי הדגשת אקטין בדרך זו, ההשפעה של blebbistatin על cytoskeleton ניתן לקבוע בדרכים רבות: מדידת השינויים העקמומיות של סיבים הלחץ אקטין, מכתים העוצמה, אורך או עובי הסיב מתח, שינויים בתכונות morphometric של סיבי אקטין או צורה וכו 'תא פרמטרים אלה ניתן למדוד גם על תמונות תא יחיד או תא העיון הסופי עצמו. כאן, ההשפעה של blebbistatin 5 מיקרומטר התאפיינה לספור את מספר התאים התמוטט באמצעות שנייה ImageJ מאקרו בשם היתר (איור 7). בקצרה, תמונות thresholded של L-micropattern משמשים להגדרת היתר התיאורטית של בצורת משולש התא. בשלב הבא, thresholding של תמונות מוכתם אקטין מתבצע על מנת לעצב משוער תא בפועל. האזור בין היתר התיאורטית של משולש התא ועל קרום התא בפועל קעור נמדד אז. כאשר התא קרסה, אזור מתחת היתר תיאורטי מופיע. האחוז של תאים התמוטט משמשת להשוואת תנאים מלאה מטופל. 6. נציג תוצאות דוגמאות של תאים מה צריך להיראות על micropatterns מיד כמה שעות אחרי הצעדים כביסה קריטי המתואר 1.6-1.8, מוצגים באיור 5. אחרי 15 דקות על CYTOOchips, עגול תאים הלה הם נצפו במרחקים שווים המציין כי הם דבקו micropatterns פיברונקטין (ציור 5a). הידבקות תושלם כאשר תאים להישאר משותקת למרות רועד עדין של כלי התרבות. כדי למזער את מספר micropatterns שנכבשו על ידי מספר תאים, שבבי סמוקות אז עם PBS להסיר תאים צפים על פני אזורים cytophobic. אחרי כמה שעות, התאים נמתחים באופן מלא על micropatterns ייראה כמו שמוצג באיור 5 ב. תמונות אופייניות תא בודד שהושג לאחר דגירה של תאים עם קיבעון blebbistatin, והכתים של אקטין גרעינים מוצגים באיור 6. לאחר הרכישה אוטומטי של מספר תמונות ועיבוד תמונה באמצעות CellRef ImageJ מאקרו, המפה בצבעים תדירות מופק המתאר את עוצמת אקטין בממוצע כל התמונות תא (איור 6 ג ו 6f). ההשוואה של התא הפניה התנאים nontreated וטופלו מראה את הפוטנציאל של גישה זו להסתכלות קל של פנוטיפ הנחקרת והוא שימושי במיוחד לחקר השפעות התרופה הסלולר. דוגמה של ניתוח אפשרי אחד של השפעת blebbistatin על תאים מוצג באיור 7. מספר תאים התמוטט (תאים כלומר, עם שטח ריק הקיימים תחת היתר תיאורטי) זיהה 50 תאים מלאה 50 תאים שטופלו blebbistatin 5 מיקרומטר כאשר זוהה על ידי המאקרו היתר ImageJ מוצג. מספר גדל של תאים התמוטט באוכלוסייה blebbistatin שטופלו משקף הרפיה של סיבי סטרס ולכן המתח על הממברנה בשל עיכוב blebbistatin כוחות actinomyosin כויץ בתוך התא. באיור 1. פרוצדורה כדי ליצור עיתון חדש עם Metamorph. דמות2. תרשים זרימה של תהליך עיבוד תמונה אוטומטי. איור 3. סינון של תאים בודדים. איור 4. בניית תא הפניה. איור 5. זריעת Cell. א) תאים הלה דבק micropatterns לאחר שלב השטיפה (הגדלה 4x) B) תאים הלה אחרי מלא מתפשטת על micropatterns L (הגדלה פי 10). איור 6. השוואה בין תאים nonpatterned ו micropatterned בשליטה התרופה התנאים טיפול. תאים הלה היו זורעים במשך 3 שעות ו שטופלו blebbistatin 5 מיקרומטר לשעה 1 (הפאנל התחתון) או מטופל (הפאנל העליון). בתאים לשלוט nonpatterned (א), לתוך סיבי אקטין מרכיב מרובים אשר לפרק מורגש על טיפול blebbistatin 5 מיקרומטר (ד). ב-L-micropatterns, תאים בקרת לאמץ צורת משולש (ב) ו לפתח סיבי אקטין הגדולות (סיבים מתח) בין 2 apices של L. בהשוואה לתאי nonpatterned (ד), blebbistatin גורם שינוי פנוטיפי גדולה על L-micropatterned תאים (ה). להדמיה ישירה של השפעות התרופה על ההשוואה של שליטה בתנאי שטופלו ניתן דמיינו במהירות עם המצגת את ההפניה לתא בנוי מ -20 תאים. בדומה תאים בודדים, סיבים מתח ברורה אינטנסיבי נמצא על תא הבקרה הפניה (ג), בעוד blebbistatin שטופלו בתאים קריסה סיבים הלחץ העיקרי נעלם (ו). איור 7. דוגמה ניתוח של ההשפעות של blebbistatin על תאים באמצעות Hypothenuse מאקרו. בעוד 25% של תאים מלאה התמוטטו, זה גדל פי 3 ל -75% בתוך 5 מיקרומטר blebbistatin תאים שטופלו המשקף את נחלש actinomyosin כויץ רשת (n = 50 תאים).