Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

1. Cell Preparation und Seeding auf Mikrostrukturen Platz 2 CYTOOchips in 2 unabhängige Vertiefungen einer 6-Well Platte sicherzustellen, dass Sie "CYTOO" in der unteren rechten Ecke des CYTOOchip lesen. Mikrostrukturen können fluoreszierend mit Cy3 oder Cy5 Farbstoffen markiert werden. CYTOOChips für dieses Experiment verwendet haben Cy3 Fluoreszenz Mikrostrukturen bezeichnet. ACHTUNG: Halten Sie Chips in der Dunkelheit. Sammeln HeLa-Zellen (~ 80% konfluent) durch Trypsinierung. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass die Zellen richtig durch die Trypsin-Behandlung verteilt. Sammeln und Zentrifuge Zellen bei 300g für 4 min, dann vorsichtig Zellpellet. Zählen von Zellen und verdünnt auf eine Konzentration von 15.000 Zellen / ml in abgeschlossenen DMEM/F12 Kulturmedien. Dispense 4 mL (60.000 Zellen) in jedes Well mit einer CYTOOchip. ACHTUNG: Die Platte sollte so wenig wie möglich bewegt werden, um zu vermeiden Induktion einer rotierenden Bewegungen in das Medium als dies dazu, um Zellen in der Mitte zu konzentrieren. Lassen Sie die Zellen Sediment für 10 min unter der Haube dann verschieben Sie sie in die Zelle Inkubator. Nach 10-20 min werden die Zellen beginnen, um die Mikrostrukturen haften. Nach 10 min, regelmäßig zu überprüfen, unter dem Mikroskop. Sobald Zellen angebracht, ändern Sie die Zell-Medium und vorsichtig spülen Deckglas Oberfläche mit dem folgenden Verfahren: Keeping die Platte flach, leicht absaugen das Medium mit einer Pipette von der Seite des Brunnens. ACHTUNG: Lassen Sie niemals den Chip austrocknen, bedeutet dies nicht absaugen alle Flüssigkeit, aber lassen genug, um die CYTOOchip jederzeit zu decken. 4 mL PBS und saugen zunächst wieder ab der Mitte des Chips gehen dann zu der Seite des Brunnens. Absaugen der PBS als ohne den Chip an der Luft beschrieben. Wiederholen Sie 3-4 mal. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop für schwimmende Zellen: Wenn eine große Anzahl von schwimmenden Zellen bleiben, wiederholen Sie den Waschvorgang. Wenn Sie sehr wenige Zellen zu sehen, absaugen Teil der PBS und ersetzen Sie es mit 2 mL frisches Medium. Absaugen und 4 ml frisches Medium zweimal. Die Platte wird in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für ein Minimum von 3 Stunden zu erlauben Zellen in voller Ausbreitung zu erreichen. HINWEIS: Mit dieser Methode zwischen 10-30% (2000 bis 6500) Mikrostrukturen durch eine einzelne oder mehrere Zellen belegt werden. ACHTUNG: Die benötigte Zeit für die Zellen vor dem Waschschritt und die Zeit für die vollständige Ausbreitung von Zellen auf Mikrostrukturen werden spezifisch für jede Zelllinie benötigt einhalten. 2. Blebbistatin Behandlung Lösen Sie die blebbistatin in 100% DMSO zu einer Stammlösung von 17 mM zu erhalten. Stammlösung weiter auf 5 mM mit 100% DMSO. Machen Sie eine Endverdünnung in Kulturmedium in einer Endkonzentration von 5 uM blebbistatin in 0,1% DMSO erhalten. Zur Kontrolle Bedingungen vorzubereiten 4 ml Medium mit 0,1% DMSO nur. Saugen Sie das Medium, auf Zellen und ersetzen sie durch die 4 ml Medium für Behandlungs-und Kontrollgruppe Bedingungen hergestellt. Inkubieren Zellen für 1 Stunde bei 37 ° C. 3. Zell-Fixierung und Färbung von Actin Zubereitung der Lösung für die Zell-Fixierung Bitte beachten Sie Reagenz Abschnitt für die Herstellung von Zytoskelett-Puffer (CB) und PFA 5%. CB ist besonders für Fluoreszenz-Markierung von Aktin-Filamenten und Mikrotubuli empfohlen. Bereiten 1xCB-Saccharose: add 1 g Saccharose zu 2 ml CB. Aufnahme von Saccharose schont internen Zellstrukturen. Bereiten Sie 4% PFA-CB-Saccharose: 1 mL 1xCB-Saccharose zu 4 ml warmes PFA 5%. ACHTUNG: Diese Lösung kann bei 4 ° C aufbewahrt werden für ein paar Tage nur. PFA Fixierung Verwenden einer Pinzette abholen CYTOOchip auf der CYTOO Logo und platziere sie (ohne Waschen) in eine Vertiefung einer 6-well-Platte mit 2 ml 4% PFA-CB-Saccharose-Lösung Inkubieren 10 min bei RT Entfernen PFA-CB-Saccharose und waschen einmal mit PBS Haben ein zweites Waschen mit 2 ml 100 mM NH 4 Cl für 10 min, um restliche PFA Vernetzung Aktivität löschen HINWEIS: PFA fixiert Dias können in PBS für mehrere Tage bei 4 ° C vor Organelle Färbung für Fluoreszenz-Imaging gespeichert werden. Permeabilisierung der Zellmembran mit Triton X-100 Permeabilisierung der Zellen mit Waschmittel können Antikörper oder andere Sonden, die Zellmembran zu durchdringen und beseitigt einige der cytosolischen Pool von Cytoskelett-Proteinen, die sonst zu reduzieren kann der Kontrast des Zytoskeletts Polymeren macht es schwierig, ihre Lokalisation zu analysieren. Entfernen NH 4 Cl und 2 mL / well von 0,1% Triton X-100-CB 3 min bei RT Zweimal waschen mit 2 mL PBS Aktinfärbung Fluorescent-Phalloidin, dieh bindet an nativen Aktin nur verwendet werden, um Aktinfilamente Fleck. 2 ml des FITC-konjugierten Phalloidin verdünnt 1:2000 in PBS mit 1,5% BSA Inkubieren 1 h bei RT Wash einmal mit 2 mL PBS Kerne Färbung Geben Sie 2 ml Hoechst (Fleck mit 1 g / mL in PBS) Inkubieren 3 min bei RT Wash 2 mal mit 2 ml PBS Montage der Folie Nehmen Sie den CYTOOchips auf der CYTOO Logo und montieren CYTOOchip auf einem Standard-Mikroskop-Objektträger mit 25-30 ul von Mowiol oder sonstige Montage-Lösung. 4. Mikroskop-Setup und Automated Image Acquisition Zahlreiche Imaging-Software-Pakete gibt, die Steuerung des Mikroskops für eine schnelle automatisierte Bildaufnahme und Anzeige. In diesem Beispiel wird Metamorph Imaging-Software und automatische Übernahmen sind auf einem Nikon Eclipse Ti-Mikroskop mit einer CCD-Kamera und einem Hamamatsu Intensilight Quecksilber-Faser-Hilfslicht ausgestattet war. Bilder werden mit 20-facher Vergrößerung in drei Wellenlängen entsprechenden DAPI (Kernen), Cy-3 (Mikrostrukturen) und FITC-Phalloidin (Aktin) erworben. Die Zahl der Mikrostrukturen visualisiert pro Feld ist abhängig von der Kamera und Ziel-Setups. CYTOO Mikrostrukturen werden in festgelegten Intervallen von einander (100 oder 130 um) auf dem Chip erheblich erleichtern Akquisition positioniert. Wählen Sie 20-facher Vergrößerung Öffnen Mehrdimensionale Bildaufnahme (in der Menüleiste: Apps / Mehrdimensionale Bildaufnahme) und richten Sie die verschiedenen Parameter des Experiments: Anzahl der Wellenlängen: 3 Wavelength-Typen: DAPI, FITC, Cy3 Set Belichtungszeit für jede Wellenlänge, indem Sie zunächst mit Schwerpunkt auf einem Feld von Zellen Autofokus kann auf jeder Wellenlänge durchgeführt werden Wählen Sie, wo die Daten zu speichern Wählen Cy3 Wellenlänge und Position der Kamera so, dass 12 Mikrostrukturen visualisiert und zentriert in der Kamera Feld (4 Spalten und 3 Reihen von Mustern) sind. Erstellen Sie eine Zeitschrift läuft Mehrdimensionale Bildaufnahme. Das Verfahren zum Erstellen einer Zeitschrift ist in Abbildung 1 beschrieben. Offene Bühne Scan-Funktion (in der Menüleiste: Geräte / Bühne / Scan Stage). Zum Erwerb 24 Bilder je 12 Mikrostrukturen bei 20-facher Vergrößerung, geben Sie 6 Spalten und 4 Zeilen mit -400 um X Schrittweite und 300 um Y-Schrittweite. In Set Journal to Execute, laden Sie die Zeitschrift MDA.JNL. Dann drücken Sie Scan, um die automatisierte Übernahme der gesamten Block in den drei Wellenlängen zu starten. HINWEIS: Die X-und Y-Schrittweite hier angegebenen werden nach der Anzahl der Mikrostrukturen in einem Kamera-Bereich variieren. Abhängig von Ihrer Bühne einzurichten, Richtung in X-und / oder Y negative Werte für Bewegung in die richtige Richtung erfordern. 5. Automatisierte Bildverarbeitung und-analyse Viele Bildbearbeitungs-und Analyse-Software-Pakete gibt. Die nachfolgend beschriebenen Verfahren skizzieren Bildverarbeitung und-analyse Schritten von 2 maßgeschneiderte Makros für die Open-Source-Programm ImageJ geschrieben durchgeführt. Das erste Makro CellRef schafft eine Referenzzelle, die zweite Hypotenuse Maßnahmen Steifigkeit / Zusammenbruch der Zellmembran. Beide sind auf Anfrage erhältlich durch www.cytoo.com . Neues Bild-Stacks für alle drei Kanäle auf Mikrostrukturen (Makro CellRef) zentriert. Verwendung von Mikrostrukturen vermeidet Zelle Clustering und Verklumpung, stark vereinfacht den ersten Schritt in der automatisierten Bildverarbeitung, die Lokalisierung und Segmentierung der einzelnen Zellen ist. Die fluoreszenzmarkierten Mikrostruktur Bilder werden verwendet, um zu definieren und abzugrenzen Regionen auf der Mikrostrukturen zentriert. Diese Regionen werden dann auf die Bilder in andere Kanäle erworben umgesetzt und beschnitten. Entsprechende beschnittene Bilder werden dann in Stapel für jede Wellenlänge zusammengesetzt. Ein RGB-Stack ist auch aus der Zusammenführung der drei Kanäle (Abbildung 2) erstellt. Übernehmen einzelne Zelle Auswahlfilter (Makro CellRef) Wie bereits erwähnt, sind 10-30% (2000 bis 6500) der Mikrostrukturen durch eine einzelne Zelle oder mehrere Zellen besetzt, während die übrigen Mikrostrukturen leer sind. Sie können die Bilder, die Mikrostrukturen von nur einer einzigen Zelle besetzt zeigen, erkennt das Makro die Anzahl der Kerne pro Bild und eliminiert aus allen Stacks (RGB und verschiedene Wellenlängen) solche mit mehr als einem Kern oder gar keine Kerne (Abb. 3). Beseitigen Sie nicht normierten und Zellen, die nicht vollständig über die Mikrostruktur gestreckt mit Zellfläche cut-off Filter (Makro CellRef) So entfernen Sie sich teilenden Zellen, dass die Kerne Filter entgangen wäre, einen anderen Filter mit dem FITC-Kanal für Aktin angewendet wird. Zellfläche berechnet und diese unter einen bestimmten abgeschnitten (Zellbereiche etwa 2-mal weniger als Interphase Zellfläche) sind von allen Stapel entfernt. Die Zellhülle Bereich wird durch die Größe des Musters bestimmt. <li> Align Zelle Bilder (Makro CellRef) Von den vorherigen Schritten wurden Bilder mit einzelnen mikrostrukturierten Zellen ausgewählt. Auch wenn diese Bilder auf Mikrostrukturen zentriert sind, werden sie niemals alle perfekt aufeinander abgestimmt. Zum Abschluss der Bildverarbeitung, ein ImageJ-Plugin (MultiStackReg) wird angewandt, um alle gesammelten Bilder und alle Kanäle auf die Mikrostruktur Position basiert auszurichten. Dieser Schritt erzeugt ausgerichtet Stapel von einzelnen Bildern, die nun für einzelne Zelle Analyse oder Schaffung einer Referenz Cell (Abbildung 4) verwendet werden können Der Aufbau eines Referenz-Cell (Makro CellRef) Wachsende Zellen auf Mikrostrukturen bedeutet, dass alle Zellen ähnliche Formen haben. Diese Normierung erlaubt eine präzise Ausrichtung und Überlagerung von vielen Zell-Bilder. Zusammenfassend das Signal in jedem Bild über den gesamten Stapel ermöglicht es, zu visualisieren und zu messen eine "durchschnittliche Drogen-Effekt". Die endgültige Gesamtbild oder Reference Cell ist ein einzigartiges und nützliches Werkzeug für die Darstellung und Bildanalyse und kann nur mit mikrostrukturierten Zellen (Abbildung 4) bezogen werden. In ImageJ, die Referenzzelle wird, indem eine Projektion des gefilterten und ausgerichtet Bilder aus einem Stapel aufgebaut (Bild> Stacks> Z-Projekt). Mehrere Projektion Methoden wie beispielsweise die durchschnittliche oder maximale Intensität aufgetragen werden aber in der Regel eine mittlere Projektion gewählt wird, die beseitigt wichtigsten Ausreißer des Bildes Stapel. Zur Erleichterung der Prüfung der Ergebnisse ist eine LUT (Look Up Tables) Umwandlung der einfarbigen Bild in eine farbcodierte Frequenz Karte angewendet. Messung und Quantifizierung von Parametern von Interesse (Makro Hypotenuse) In diesem Video-Artikel sind L-Mikrostrukturen verwendet, weil die Form organisiert das Aktin-Zytoskelett in einen einzigen großen Stress Faser. Durch die Hervorhebung Aktin auf diese Weise kann blebbistatin die Auswirkungen auf das Zytoskelett in vielen Arten bestimmt werden: die Messung von Veränderungen in der Krümmung des Aktin-Stress-Faser, Färbeintensität, Länge oder Dicke des Stress-Faser, Änderungen in morphometrische Merkmale des Aktin-Filamenten oder Zellform etc. Diese Parameter können entweder auf einzelne Zelle Bilder oder auf die letzte Referenz Zelle selbst gemessen werden. Hier wurde der Einfluss von 5 uM blebbistatin durch Zählen der Anzahl der eingestürzten Zellen mit einem zweiten ImageJ Makro namens Hypotenuse (Abbildung 7) charakterisiert. Kurz gesagt, werden Schwellenwert Bilder der L-Mikrostruktur verwendet werden, um eine theoretische Hypotenuse der Zelle Dreiecksform zu definieren. Als nächstes wird Schwellenwert des Aktin gefärbt Bildern durchgeführt, um annähernd den tatsächlichen Zellform. Der Bereich zwischen der theoretischen Hypotenuse der Zelle Dreieck und dem tatsächlichen konkave Zellmembran wird dann gemessen. Wenn die Zelle zusammengebrochen ist, wird ein Bereich unterhalb des theoretischen Hypotenuse. Der Anteil der kollabierte Zellen genutzt, um Kontrolle zu vergleichen und behandelt Bedingungen. 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele von dem, was Zellen möchte auf Mikrostrukturen sofort schauen und mehrere Stunden nach der kritischen Waschschritten in 1,6 bis 1,8 beschrieben werden, sind in Abbildung 5 dargestellt. Nach 15 min auf CYTOOchips, sind rund HeLa-Zellen in gleichen Abständen darauf hinweist, dass sie auf die Fibronektin Mikrostrukturen (Abbildung 5a) eingehalten beobachtet. Die Haftung ist abgeschlossen, wenn die Zellen immobilisiert trotz leichtem Schütteln des Kulturgefäßes bleiben. Zur Minimierung der Anzahl der Mikrostrukturen von mehreren Zellen besetzt sind Chips dann mit PBS gespült, um Zellen schweben über dem cytophobic Bereichen zu entfernen. Nach mehreren Stunden werden die Zellen, die vollständig über die Mikrostrukturen sind gespannt, wie sie in Abb. 5b gezeigt aussehen. Typische einzelne Zelle Bilder nach Inkubation von Zellen mit blebbistatin, Fixierung und Färbung von Aktin und Kerne sind in Abbildung 6 dargestellt. Nach automatisierte Übernahme von mehreren Bildern und Bildverarbeitung mit dem ImageJ CellRef Makro ist eine farbcodierte Frequenz Karte generiert, zeigt die Intensität der Aktin gemittelt über alle Zellen Bilder (Abb. 6c und 6f). Der Vergleich der Referenzzelle für unbehandelten und behandelten Bedingungen zeigt das Potenzial dieses Ansatzes für die einfache Beobachtung des Phänotyps unter Studium und ist besonders nützlich für die Erkundung zellulären Arzneimittelwirkungen. Ein Beispiel für eine mögliche Analyse der Wirkung von blebbistatin auf Zellen ist in Abbildung 7 dargestellt. Die Zahl der Zusammenbruch Zellen (dh Zellen mit einem leeren Bereich bestehenden unter dem theoretischen Hypotenuse) in 50 Kontroll-Zellen erkannt und 50 Zellen mit 5 uM blebbistatin behandelt werden, als von der ImageJ Hypotenuse Makro erkannt wird, erscheint. Die erhöhte Anzahl von zusammengebrochen Zellen in der blebbistatin behandelten Population spiegelt Entspannung der Stress-Fasern und damit Spannung an der Membran durch blebbistatin Hemmung der actinomyosin kontraktilen Kräfte innerhalb der Zelle. Abbildung 1. Vorgehensweise, um eine neue Zeitschrift mit Metamorph erstellen. </p> Abbildung 2. Flussdiagramm der automatischen Bildverarbeitung Verfahren. Abbildung 3. Herausfiltern einzelner Zellen. Abbildung 4. Building a Reference Cell. Abbildung 5. Zellaussaat. A) Hela Zellen Mikrostrukturen nach dem Spülschritt (4-fache Vergrößerung) eingehalten B) HeLa-Zellen nach der vollständigen Verteilung auf L Mikrostrukturen (10fache Vergrößerung). Abbildung 6. Vergleich nonpatterned und mikrostrukturierten Zellen in Kontroll-und Drogen behandelt Bedingungen. HeLa-Zellen wurden für 3 Stunden ausgesät und mit 5 uM blebbistatin für 1 Stunde (unteres Bild) oder unbehandelt (oberes Bild). In der Kontrollgruppe nonpatterned Zellen (a), montiert Aktin in mehrere Fasern, die sich unmerklich nach Behandlung mit 5 uM blebbistatin (d) zu demontieren. Auf L-Mikrostrukturen, Kontroll-Zellen eine dreieckige Form (b) erlassen und entwickeln eine große Aktin-Faser (Stress-Faser) zwischen den 2 Spitzen der L. Im Vergleich zu nonpatterned Zellen (d), induziert blebbistatin eine große phänotypische Veränderungen auf L-mikrostrukturierten Zellen (e). Direkte Visualisierung von Arzneimittelwirkungen und den Vergleich von Kontroll-und behandelten Bedingungen können sich schnell visualisiert werden mit der Referenzzelle Präsentation aus 20 Zellen aufgebaut. Ähnlich wie einzelne Zellen, ist eine klare und intensive Beanspruchung Faser, die zur Kontrolle Reference Cell (c), während blebbistatin Zellen kollabieren und den großen Stress Faser verschwindet (f) behandelt. Abbildung 7. Beispiel für eine Analyse der Auswirkungen von blebbistatin auf Zellen mit dem Makro Hypotenuse. Während 25% der Kontroll-Zellen wurden zusammengebrochen, das 3-fache auf 75% erhöht in den 5 uM blebbistatin behandelten Zellen spiegelt die geschwächte actinomyosin kontraktilen Netz (n = 50 Zellen).