Desarrollar ovario de hámster chino anfitrión-ensayos con células de proteínas utilizando la tecnología de membrana acústica de micropartículas

1. Preparación de micropartículas Los anticuerpos con biotina etiqueta NHS Química Determinación del grado de biotinilación Conjugado estreptavidina bolas con anticuerpos con biotina Volver a suspender las bolas en el vial original por agitación durante 1-2 minutos Alícuota del volumen deseado de granos en un tubo de microcentrífuga Lavar las perlas de tres veces con PBST: Coloque el tubo que contiene las cuentas en el imán durante 2 minutos Eliminar el sobrenadante por aspiración con el tubo en el imán. Tenga cuidado de no alterar las cuentas Retire el tubo del imán y añadir 1 ml de PBST Vortex durante 20 segundos para volver a suspender las cuentas Centrifugar durante 5 segundos para eliminar las cuentas de la tapa Repetir dos veces más 2.3.1-2.3.5 Después del tercer lavado lugar el tubo en el imán y aspirar el PBST Añadir anticuerpo biotinilado a las perlas y resuspender Si es necesario llevar el volumen de los anticuerpos con biotina hasta 300 ml con PBS. Si el volumen de anticuerpos ya es mayor de 300 l no añadir PBS Incubar la suspensión de bolas / anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador vortex o rotor del tubo Lavar 3 veces con PBST como en el paso 3. Bloquear cuentas con biotina BSA Después del tercer lavado añadir 10 mg / mg biotina BSA, ajustar el volumen a 300 ml con PBS, si es necesario, e incubar con agitación durante 30 minutos Lavar 3 veces con PBST como en el paso 3 Volver a suspender las bolas en 100 L de PBS/0.05% de BSA. Azida de sodio puede ser agregado para almacenamiento a largo plazo Utilizando protocolos estándar NHS con fluoresceína, fluoresceinato el anticuerpo detector Determinar el grado de Fluorescination 2. HCP – Desarrollo Prepare las soluciones de trabajo: Anticuerpos fluoresceína (FL-Ab): La mayoría de los ensayos de CHO-HCP uso Fl-Ab a una concentración final de 400 ng / mL. El FL-Ab se agrega como ¼ del volumen final del ensayo, por lo tanto, la concentración de la solución de trabajo es de 1,6 mg / ml. Preparar esta solución diluyendo acciones gordura con BioScale bolas / diluyente de flacidez. Cuentas: La mayoría de los ensayos de CHO-HCP utilizar cuentas a una concentración final de 2×10 5 cuentas / ml. El reactivo de cuentas constituye una cuarta parte de el volumen final del ensayo, por lo tanto la concentración de la solución de trabajo es de 8×10 5 cuentas / ml. Preparar esta solución diluyendo acciones de bolas con bolas BioScale / diluyente de flacidez. Vortex el stock de cuentas y para asegurarse de que todas las cuentas están en suspensión antes de extraer una alícuota. Running Buffer: La composición del tampón de que tenga que ser optimizado para los anticuerpos utilizados para desarrollar el ensayo, sin embargo, varios CHO-HCP ensayos se han desarrollado utilizando tampón HEPES 10 mM, 1% de Tween, pH 7,5. BioScale ha desarrollado un aditivo para el funcionamiento de amortiguación (suministrado con el kit de desarrollo) que se añade al tampón a una concentración del 1% antes de su uso. Diluir los calibradores y las muestras con diluyente de la muestra BioScale. 3. VIBE de configuración del sistema A su vez la estación de trabajo Vibe Conecte el sistema de suministro y de los residuos Cebe el sistema de Introducir los cartuchos de ViBE Ruta de los tubos Preparar plantilla de ensayo rellenando la hoja de la etiqueta "Configuración de la muestra". BioScale ofrece la posibilidad de tener una plantilla de ensayo para cada ensayo de estación de trabajo VIBE. Esto permite al usuario editar y guardar notas específicas en las "Notas" hoja de la plantilla para los ensayos de diferentes manteniendo un registro completo de la experiencia. Plantilla de ensayo de la configuración inicial: Comience por llenar la mesa (en la esquina superior izquierda) del rango de concentración de los estándares en el ensayo en la "configuración de muestra" de hoja. A continuación, introducir información adicional en la tabla a la derecha de las normas (configuración de columna simple lectura, One Agregar reactivo y dos configuraciones de reactivo Añadir) para instruir a la estación de trabajo ViBE el número de muestras a largo necesario para la incubación, la cantidad de volumen de reactivo se va a transferir , ¿cuánto tiempo la acumulación de la muestra tiene que ser, y si de acondicionamiento del sensor y la descontaminación de las sondas y el cartucho son necesarios, etc Rellene el diseño de la placa. Carga de la muestra / reactivos en las placas. El VIBE proporcionará los volúmenes necesarios para el plato de reactivos. Volumen de la muestra puede variar, pero en medio de un volumen de ensayo total de 120 l es un buen punto de partida. Aplicar cubiertas de la placa. Placas de carga sobre la cubierta de estación de trabajo. Realizar el ensayo en marcha el asistente, vaya a través de asistente e iniciar la prueba. 4. Resultados representante Figura 1: Como parte del proyecto de Inmunoensayo Sandwich </p> En una estación de trabajo VIBE, un ensayo parte del proyecto se mide la concentración de antígeno. La señal se mide cuando el anticuerpo-antígeno-cordón hapteno se une al sensor a través del hapteno / interacción anti-hapteno. Regeneración lleva el sensor de nuevo al estado comenzando por la eliminación de los complejos inmunes. Figura 2: CHO-HCP Ensayo Como parte del proyecto curva de calibración La figura 2 es un ejemplo de una curva de calibración CHO HCP Como parte del proyecto de ensayo. El análisis puede llevarse a cabo en muestras de toda la corriente de purificación incluyendo el reactor de alta precisión y reproducibilidad. Figura 3: Proteína Una curva de calibración del ensayo parte del proyecto La figura 3 es una curva de calibración para una proteína residual Un ensayo Como parte del proyecto, realizado con una proteína residual VIBE un kit de ensayo. El mismo kit puede ser utilizado para un ensayo más rápido con un período de incubación de 30 minutos, o para obtener resultados más sensible y más amplio rango dinámico, con un período de incubación más largo, sin pérdida de precisión o exactitud, los cuales suelen ser mejores que sus equivalentes ELISA en los usuarios manos Figura 4: El producto Titer Como parte del proyecto de ensayo La estación de trabajo ViBE también se puede utilizar para un ensayo Titer producto, resultados que se muestran en la Figura 4. Realiza de forma diferente que los otros ensayos Como parte del proyecto, este ensayo no requiere tratamiento de la muestra que no sea la simple dilución, o perlas, y la cuantificación se ha verificado en "sin efecto" las muestras que contienen más de 10 millones de células en un amplio rango de viabilidad. Figura 5: Ensayo Como parte del proyecto curva estándar para GST-Gadd34 biomarcador ensayo Muestra en la Figura 5 es una curva de nivel de señal que se obtiene por el Bioanalyzer Vibe (Grupo A) o Tecnología AlphaScreen utilizando recombinante GST-Gadd34. Resultados en la plataforma ViBE fueron de aproximadamente un registro más sensible con los mismos anticuerpos. Como parte del proyecto aprovecha la medición de partículas de mayor tamaño menos y aún así los beneficios de la captura en fase de solución y la formación de complejos de detección. Figura 6: Curva Como parte del proyecto de ensayo estándar para la GST-Gadd34 en una muestra de tumor En la figura 6, la inducción de Gadd34 de CWR22 xenoinjertos fue probado en la presencia o ausencia de un inhibidor del proteasoma boronato como se ha analizado tanto por el Bioanalyzer Vibe (Grupo A) o AlphaScreen (Grupo B). La plataforma ambiente era capaz de producir resultados sensibles y reproducibles en los xenoinjertos de tumores in vivo, mientras que la señal se interrumpió con AlphaScreen mg cada vez mayor de proteínas. Este ejemplo muestra el poder de la tecnología Como parte del proyecto en las muestras de gran complejidad. Debido a que el chip de detección sensibles y de alto rendimiento del imán cerca de los chips, bajo número de micropartículas magnéticas de manera eficiente y reproducible para la meta recoger baja abundancia en medio de la complejidad de la lisis celular (incluidos los reactivos de lisis) y restos de sangre.