Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

1. Hazırlık Taze 3 Bu oran 06:03:01 sırasıyla mutlak etanol, kloroform ve buzul asetik asit birleştirerek Carnoy Kullanıcı fiksatif hazırlamak yanı sıra daldırarak yaka için tüm çözümleri (öneri için reaktifler bölümüne bakınız) cam boyama kavanoz içinde muhafaza edilmelidir. Alüminyum folyo hazırlayın yaka için doğru boyutu cebe. 2 X% 40 etanol,% 70 etanol, 2 X% 100 etanol, methylbenzoate (MB), 50/50 v / v MB ve parafin, 2 X parafin: kavanoz boyama aşağıdaki çözümleri hazırlayın. 60-65 ° C için bir kuluçka set MB ve parafin kapları koyun. 60-65 ° C folyo ceplerine dökmek Sıcak parafin 2. Sinekler yaka içinde Tespit Binoküler altında dikey konumda sinek için giriş noktası görebileceğiniz bir bant kullanarak yaka 4 takın. Anestezisi bir buz bloğu kullanarak karbon dioksit veya hipotermi ile uçar. Sineklerin dondurmak için dikkatli olun. Forseps kullanarak, doğru yönde (bıçakları ve bıçaklar altında karnın üst baş ve göğüs) yaka içine kanatları ve yer kapma bireysel sinekler pick up. 10-20 sinekler yaka kolayca sığacak gerekir. Not: Birden fazla genotipleri analiz yapıyorsanız, yaka numarasını ve ilgili genotip bir yere not etmeyi unutmayın. 3. Drosophila Thoraxes Parafin Bölüm Carnoy çözümü için yaka yerini değiştirin ve doku düzeltmek 4 ° C, gece boyunca. Fiksasyon sonra, etanol artan konsantrasyonlarda kullanarak örnek kurutmak. 10 dakika her biri% 40 (2 kez),% 70 ve% 100 oda sıcaklığında (2 kez) etanol içine daldırın yaka için. Sonraki inkübe MB ve MB + parafin çözüm (1:1) yaka ve her 30 dakika için 60-65, her biri için 60 dk iki değişiklik parafin ° C yaka sızmak Hızla folyo cebine yaka taşınmaya ve erimiş (60-65 ° C) parafin ile doldurun. Oda sıcaklığında yerleştirin ve parafin (o gecede terk etmek en iyisidir) sabit hale izin. Yaka (boyuna veya enine) bölümleri yönünü bağlı olarak, farklı yönelimleri folyo cebe yerleştirilir olduğunu unutmayın. Folyo yaka kuru parafin blokları Unwrap ve parafin blok hafifçe yaka ayrı. Sinek doku etrafında ekstra parafin, keskin bir bıçak ya da neşter yardımıyla dikkatlice kesip. Kes bir dönme mikrotom 7-10 mikron bölüm adımlarla parafin blok ve 37 ° C su banyosunda kesilen doku düz float izin. Kutup slaytlar kesitli doku yerleştirin ve gece boyunca kurumasını bekleyin. Bu slaytlar Hematoksilen ve eozin ile boyanması için kullanılabilir (Şekil 1A-B), toluidin mavi, anilin mavisi veya diğer ölür doku yapıları görselleştirmek için, hem antikor boyama gibi (Şekil 1E-E “). 4. Drosophila Thoraxes, Cryosections Parafin bölümlerde olduğu gibi, bir yaka ve moda bir alüminyum folyo cep sinek hazırlamak. Dondurma soğutucusu örnekleri hazırlamak için gerekli olacaktır. Soğutucu -60 civarında olduğundan emin olun ° C, bu sıcaklık ulaşmak için izin vermek için küçük bir etanol ve kuru buz kullanın. Deney başlamadan önce bir saat soğumasını ve hava kabarcıklarının oluşumunu en aza indirmek için 4 ° C buzdolabı ters cryo gömme orta şişe (Doku Tek Ekim bileşik) koymak. Dondurucu soğutucu içinde birkaç dakika için ön soğutmalı ve hızla cryo gömme bileşik ile doldurun olmuştur folyo cebe sinekler yaka yerini değiştirin. 3-10 dakika için örnek donmasına izin. Dikkatle, soğutucu içinde oluşan blok unwrap yavaşça gömme blok yaka ayrı ve en az bir gün için -20 ° C'de koydu. -15 Ve -18 ° C arasında bir mikrotom cryo bir bölümü 10-15 mikron kalınlığında donmuş kasları kesin. Polarize slaytlar yerleştirin ve daha fazla işlem yapmak için hazır olana kadar -20 ° C'de tutmak. Antikor boyama önce oda sıcaklığında 10 dakika için% 4 formaldehit PBS çözüm doku sabitleme öneririz. 5. Drosophila Kaslar Lipidler Algılama Lipid damlacıkları yağı kırmızı O Sieber ve Thummel 5 kabul edilen bir protokol kullanarak cryosections leke ile tespit edilebilir . Fiksasyon sonra, 5 dk, 10 dk inkübe 3 yağ kırmızı O saat oda sıcaklığında leke için propilen glikol dengelenmiş slaytlar için iki kez su ile yıkayın. Ardından, propilen glikol ve PBS içinde 30 dakika 5 dakika örnekleri 2 kez yıkayın. % 30 gliserol Dağı. 6. Temsilcisi Sonuçlar: Incirure 1. Parrafin-gömülü bölümleri Dolaylı uçuş kaslarına Hematoksilen ve eozin boyanmış enine (AB) ve boyuna (CD) bölümleri. A ve C normal yapılandırılmış kasları gösterir. Anormal boyutu ve morfolojisi kasları sırasıyla B ve D (siyah ok) temsil edilmektedir. Anti-LamC leke nükleer (EF), çekirdek zarı marker ve DAPI, Drosophila toraks boyanmış enine bölümü. Normal büyütülmüş görünümü (kırmızı ok) ve bozulmuş (sarı ok) kasları (F). G LamC ve DAPI Drosophila bağırsak boyanan bölümünde temsil eder. Şekil 2. Frozen Drosophila toraks yağı kırmızı O, lipid damlacıkları etiket ile boyanmış A. Transvers frozen. B. dolaylı uçuş kaslarına Boyuna frozen anti-Dg, kas sarcolemma işaretleyici ve DAPI ile boyandı.