Negatif Seçilebilir Marker Geliştirme Entamoeba histolytica</em

1. Entamoeba histolytica FCU Negatif Seçim Sistemi Vektör kontrol hattı (HM1 / pKT3M) ve deneysel hattı (HM1/pKT3M-FCU1), daha önce açıklanan teknikler 1,2 üretildi . Tohum T-25 ölçülü balona stok tüpleri çalışma altında hatları ve TYI-S-33, 3 orta uygun antibiyotik (12 mg / ml G418) ekleyerek seçimi korumak . Matara 37 büyüme 16-18 saat sonra% 70-80 konfluent olmalıdır ° C Sıcak TYI-S-33 orta, 5-florositozin (5-FC, Sigma) taze bir 50mm stok solüsyonu hazırlayın. Vortex titizlikle birkaç dakika için tamamen çözmek için 5-FC. Filtre sterilize filtresi 0.22 mikron geçirilerek stok solüsyonu. 3-5 dakika buz üzerinde şişeler yerleştirerek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200xg santrifüj hücreleri toplamak Hasat trofozoitleri. Taze TYI orta pelletini tekrar ve hücreleri saymak. Tipik bir deney tasarımı, son hacim 1 ml 48 plaka başına 0.5 x 10 4 hücreleri kullanır; ve her bir test durumu için üç nüsha tekrarlar . Buna ek olarak, floresan ölçümleri kolaylaştırmak için, her zaman noktası başına suşu için ayrı bir plaka kullanılır. Her test 5-FC, konsantrasyon, üç nüsha halinde de her Tohum 0.5 x 10 4 hücreler. TYI orta antibiyotik seçimi basınç koruyun. Şimdi 5-FC stok solüsyonu ve her kuyuya trofozoitleri gereken miktarda ekleyebilirsiniz. 37, anaerobik bir torba içinde tabak inkübe ° C 2. Seçim Verimliliğinin Belirlenmesi 2 mg / ml DMSO Hücre tracker yeşil CMFDA (Invitrogen) stok solüsyonu hazırlayın. Çalışma çözeltisi, stok serum serbest TYI ortamda 1000 kat sulandırmak yapmak için. Orta trophozoite kültür plakaları tamamen kaldırın ve 150 mcL serum serbest TYI içeren CMFDA ile değiştirin. Devam az 37 inkübasyon ° C 1 saat. Kuyulardan boya çözüm çıkarın ve SPECTRAmax M2 mikroplaka spectrofluorometer plaka okuma. Dalgaboyu 492 nm dalga boyunda ve 517 nm okuma floresans emisyon olmalıdır. Test transfektanları karşı kontrol hücreleri için floresan değerleri karşılaştırın. Her bir zaman aralığı plakaları okumaya devam edin. Her plaka uygun pozitif (TYI sadece) ve negatif (25 mg / ml hygromycin) kontrol kuyuları kullanın. 3. Temsilcisi Sonuçlar E. histolytica transfektanları kodon optimize edilmiş rekombinant FCU1 (Şekil 1) sağlam bir ifade gösterdi. Bu protokol E. seçici eleme sonuçları doğru takip edildiğinde 0.5 mM 5-florositozin varlığı FCU1 ifade histolytica hücreleri. Kontrol hücreleri, aksine 5-FC, 5 mM konsantrasyonu normalde kadar büyüyebilir ve 72 ve 96 saatleri arasında izdiham ulaşmak devam (Şekil 2-a). Tedavi edilen kuyuların bir mikroskop altında incelendi 48 saat FCU1 taşıyan hücreleri tamamen parçalanmış. Bunlar da örnekleri çok sayıda (Şekil 2-b) içeren kantitatif çalışmalarda kullanılan hayati, boya CMFDA ile boyanarak floresan azalma gösterir. FCU1/5-FC sistemi E. için etkili ve güçlü bir negatif seçim aracı histolytica trofozoitleri. Şekil 1. E. Üretimi negatif seçilebilir işaretleyici ifade histolytica HM1 transfektanları (A) FCU1 rekombinant protein, anti-c Myc antikor (üst panel) kullanarak bir western blot tespit edildi . Beklendiği gibi, bir 42kDa bant değil sadece vektör kontrolü transfektanları FCU transfektanlarından toplam lizat (bir ok ile gösterilen) tespit edilebilir. Alt panel aynı leke yükleme kontrolü gibi anti aktin antikor probed gösterir. (B) kantitatif gerçek zamanlı PCR Sonuçları lgl4 kontrol etmek için normalize FCU1 spesifik mRNA ifadesi gösteriyor. E. Şekil 2 in vitro ilaç duyarlılığı negatif seçilebilir işaretleyici ifade histolytica transfektanları (A) kontrol transfektanları ve (b) FCU1 ifade transfektanları 48 plaka kültür sağkalım eğrileri. Hücreleri artan konsantrasyonlarda varlığı yetiştiği prodrogu-5-florositozin; X-ekseni üzerinde gösterilir hücre sağkalım CMFDA boyama ile her bir zaman aralığı belirlendi. Y ekseni floresan birimleri temsil eder ve hücrenin hayatta kalan nüfusun doğrudan bir yansımasıdır. FCU1 ifade transfektanları 0.5mm prodrogu konsantrasyon, kontrol ile karşılaştırıldığında önemli bir duyarlılık gösterdiğini dikkat ediniz. Hücreleri com bu kuyulardan 120h zaman noktasında gözlendiilgili kontrol kuyuları (veriler gösterilmemiştir) mikroskop altında görülen konfluent büyüme için hazırlandık. Higro negatif kontrol olarak kullanılan 25μg / ml hygromycin gösterir.