私達は中の負の選択システムの開発について報告する<em> E.赤痢</em>トランスジェニックキメラタンパク質の発現(FCU1)およびプロドラッグ5 – フルオロシトシンと選択に基づいて。 FCU1タンパク質は、酵母のシトシンデアミナーゼおよびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの融合です。 FCU1の発現は増加をもたらした<em> E.赤痢</em5 – フルオロに向かって>感度。
赤痢アメーバはアメーバ症の原因物質であり、世界人口の10%まで感染します。遺伝子発現のアップとダウンレギュレーションを有効にしている分子技術は、安定的に維持プラスミドのトランスフェクションに依存しています。これらは、赤痢アメーバの病原因子についての理解を増加している一方で、逆遺伝学の実験を可能にするゲノムに外来DNAを統合する能力は、、この寄生虫の研究で大きな利点となります。この微生物によって提示される課題は、相同組換えのイベントとトランスフェトロフォゾイトからエピソーム、プラスミドDNAを治すために困難のために選択することができないことなどがあります。外因性DNA、善意のゲノム統合イベントが発生したトロフォゾイトの同定における主要な問題の高バックグラウンドで後で結果。我々は、酵母のシトシンデアミナーゼとウラシルプロドラッグ5 – フルオロシトシン(5 – FC)とホスホトランスフェラーゼキメラ(FCU1)と選択のトランスジェニック発現に基づいて、負の選択システムの開発について報告する。 FCU1酵素は毒性の5 -フルオロウラシル、5 -フルオロウリジン-5' -モノリン酸。E.に非毒性の5 – FCを変換するFCU1を表現赤痢ラインはコントロール株と比較してプロドラッグに対してより敏感に30倍であることがわかった。
赤痢アメーバの分子生物学的ツールの大幅な進歩があったが4の遺伝子を削除したり、混乱させるために利用できる現在の方法はありません。遺伝子特異的発現のノックダウンは、ヘアピンRNA 5の使用によって達成低分子干渉RNA 6と細菌のdsRNA 7を発現されている。しかし、それぞれの標的遺伝子の中に効果的なこれらの方法は、高価な化学物質の使用、抗生物質と時間の経過とともに発生復帰の高い発生率に起因する一定の検証の必要性に対する継続的な選択(アリシアリンフォード、私信)8を含むいくつかの制限があります。
DNA複製9の起源のための厳密な順序の要件が明らかにないとして、任意のプラスミドは、 赤痢アメーバに複製することができ、ので、一度トランスフェクション、それは通常、プラスミドを治すことは困難です。これは、組換えと遺伝子ノックアウト実験で無傷プラスミドの活用可能性を制限する。負の選択マーカーは、それらが組換え亜集団を排除するために使用できるようにメソッドを遺伝子ターゲティングの重要なコンポーネントです。私たちは正常にコドン赤痢アメーバでFCU1遺伝子を最適化し、負の選択マーカーとしての可能性をテストを表明している。この遺伝子の融合は、ヒト腫瘍細胞の自殺遺伝子治療のために使用され、RNAとDNA合成10の阻害をもたらす有毒な川下製品へのプロドラッグ5 – FCを代謝されています。 FCU1は最近マラリア 、別の原生動物寄生虫における負の選択マーカーとして使用されています。FCU1を表現マラリアberghei細胞は 5 – FCとのin vitroおよび in vivo治療におけるプロドラッグへの約1000倍感度が高くなることが判明したのは、99.9%以上死滅マラリア11の赤血球段階のマウスモデルにおける組換え寄生虫に感染。E.は FCU1を発現している赤痢細胞はP.で観測された感度とは対照的にプロドラッグ5 – FC〜30倍高い感度を示したberghei。このために考えられる理由は、有毒な代謝産物と競合する増殖培地で利用可能なヌクレオチドの大規模なプールである可能性があります。
P.両方のbergheiとP.熱帯熱マラリア FCU1マーカーは、標的遺伝子破壊に使用されています。研究11,12。我々は、相同組換えを用いた赤痢アメーバのゲノムを操作することを目指しています。 FCU1/5-FCネガティブ選択系の検証は、この目標に向けた重要なステップです。
The authors have nothing to disclose.
我々はFCU1遺伝子の配列を我々に提供するための博士フィリップのERBSを感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金AI 26649によってサポートされていました。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | ||
5-Fluorocytosine | Sigma | F7129 | ||
Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | ||
Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |