זה פרוטוקול וידאו מדגים את שיטת assay neurosphere ליצור ולהרחיב בתאי גזע עצביים מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור.
Abstract
בידוד והתרחבות של תאים המשוערת גזע עצביים (NSCs) מהמוח Murine מבוגר תוארה לראשונה בשנת 1992 על ידי ריינולדס וייס העסקת הגדרה כימית סרום ללא מערכת התרבות המכונה assay neurosphere (NSA). ב assay זה, רוב סוגי תאים מובחנים למות בתוך ימים ספורים של תרבות אלא אוכלוסייה קטנה של גורם הגדילה התאים מגיבים מבשר לעבור התפשטות פעיל בנוכחותו של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו / צמיחה בסיסי גורם fibroblastic (bFGF). תאים אלה יוצרים מושבות של תאים שלא עברו התמיינות בשם neurospheres, אשר בתורו יכול להיות subcultured כדי להרחיב את מאגר בתאי גזע עצביים. יתר על כן, התאים יכול להיגרם להבדיל, שהניבו את שלושת סוגי התאים העיקריים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית, כלומר האסטרוציטים, ו oligodendrocytes. Assay זה מספק כלי רב ערך כדי לספק מקור עקבי, מתחדשת של מבשרי CNS מובחן, אשר יכול לשמש עבור במבחנה וגם למטרות טיפוליות.
וידאו זה מדגים את שיטת NSA ליצור ולהרחיב NSCs מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור. ההליך כולל קצירת המוח של העכבר הבוגרת, מיקרו דיסקציה של האזור periventricular, הכנת הרקמה והתרבות של NSA. הרקמה שנקטפו הוא הראשון מתעכל כימית באמצעות טריפסין-EDTA ולאחר מכן ניתק מכני בינוני NSC להשיג ההשעיה תא יחיד מצופה לבסוף ב NSA. לאחר 7-10 ימים תרבות, neurospheres העיקרי הנובע מוכנים תת להגיע כמות התאים הנדרשת בניסויים עתידיים.
Protocol
<p class="jove_title"> חלק 1: מערכת בסיסית עד לפני שתמשיך לנתיחה:</p><ol><li> נפח מתאים של המדיום המל"ל להשלים הוא מוכן על ידי ערבוב NeuroCult בינוני NSC הבסיס, NeuroCult NSC תוספי הפצת ביחס 9:01 בהתאמה. בינוני NSC אפשר גם במעבדה מבוסס על הרכב הצמיחה NSC בינוני שפורסמו בספרות<sup> 1</sup>. אם המעבדה שלך אין הרבה ניסיון עם ביצוע בינ?…
Discussion
Assay neurosphere 2 צברה תשומת לב רחבה בקהילה המחקר לא רק בידוד המחקר של מערכת העצבים המרכזית NSCs מ 4-5, אלא גם עבור בידוד של סוגים אחרים של בתאי גזע המשוערת מרקמות רבות, כמו חזה ולב 6 ו 7 לצורך זיהוי של השד המוח, גידול במעי הגס בתאי גזע 8-9 טוען כי מערכת ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אוברסטריט.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
NeuroCult NSC Basal Medium
Medium
Stem Cell Technologies
05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements
Medium supplement
Stem Cell Technologies
05701
%0.05 trypsin-EDTA
Reagent
Gibco
25300-062
Soybean trypsin inhibitor
Reagent
Sigma
T6522
Cell strainer
Sieve
BD Falcon
352340
T25 flask
Culture ware
Nalge Nunc international
136196
T80 flask
Culture ware
Nalge Nunc international
178905
EGF
Growth factor
R&D
2028-EG
Pen/Strep
Reagent
Gibco
15140-122
*MEM
Reagent
Gibco
41500-018
HEM component
*HEPES
Reagent
Sigma
H4034
HEM component
*Distilled water
Reagent
Gibco
15230-147
15 ml tubes
Culture ware
BD Falcon
352096
50 ml tubes
Culture ware
BD Falcon
352070
Fine curved forceps
Surgical tools
Fine Science Tools
11251‐35
Small fine forceps
Surgical tools
Fine Science Tools
11272‐30
Small forceps
Surgical tools
Fine Science Tools
11050‐10
b-FGF
Growth factor
R&D
3139-FB
Heparin
Growth factor
Sigma
H4784
Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393, doi:10.3791/2393 (2010).