1. Poli-L-láctico (PLLA) Spinning Solution Dissolver 0,4 g PLLA em 9 mL de clorofórmio por agitação em fogo baixo. Adicionar 1 mL dimetilformamida para a solução, trazendo a concentração final da solução para PLLA 4% (w / v) em clorofórmio: DMF 9:1 (v / v). Coloque a solução em um polipropileno ou seringa de vidro com uma ponta de metal blunt 23ga. 2. Spinning Preparação do Substrato 1 Faça uma solução de 8% (w / v) de PLGA 85:15 (poli-lático-co-glicólico ácido) em clorofórmio por agitação em fogo baixo. Revestimento de vidro limpo lamínulas em PLGA cobrindo a superfície de cada lamínula com a solução de PLGA. Permitir que o PLGA para secar a uma película fina (aprox. 30 min). 3. Eletrofiação 2 Seguro PLGA tampa de vidro revestido desliza para colecionador com fita de carbono condutora. Para fibras alinhadas, o coletor é uma roda motorizada. Para fibras aleatórias, o coletor é uma placa estacionária. Seringa lugar na ponta da bomba com 20 cm de roda de colecionador. Conjunto de bomba a cerca de 2 mL / hr e se estiver usando uma roda, conjunto do motor para 300-400 RPM. Se possível, aplique um viés -2 kV DC para o coletor e 15 kV a ponta de metal. Na ausência de acesso a uma fonte de alimentação bipolar, terra do coletor. Fibras será jato da ponta da seringa e recolher na roda girando. Continue girando até que a densidade desejada de fibras é obtido. Passe a ponta de metal com uma toalha de papel afixado a uma haste não-condutor periodicamente para evitar entupimento na ponta. 4. Moating 1 Spinning seguinte, 'fosso' as amostras electrospun pipetando uma linha de PLGA em todo o perímetro da lamínula. Permitir que o PLGA para secar. Isto irá manter o alinhamento das fibras durante a cultura. 5. Revestimento de proteína Fibras de vidro electrospun e controles precisam ser revestidas em proteínas antes de cultura de células. Cobrir os substratos em uma solução de proteína, pelo menos, uma hora e depois aspirar o excesso de solução e continuar aspirando até os substratos estão secos. Soluções de proteína possíveis incluem: PLL (poli-L-lisina) (100 mcg / mL), laminina (25 mcg / mL) ou fibronectina (50 mcg / mL). Se PLL é utilizado, os substratos devem ser lavados em água estéril e seco duas vezes após o revestimento inicial. 6. Obtenção de embriões de ratos 3 E15 * Todos os experimentos foram feitos de acordo com o Guia de NIH para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, aprovado pela Universidade de Michigan Comissão de Uso e Cuidados dos Animais. Preparação: Verifique se o animal está grávida. Descongelar 3 mL de tripsina, 3 mL FBS e uma garrafa quente do L15. Fogo polonês uma pipeta Pasteur. Desinfectar todos os instrumentos cirúrgicos em etanol 70% por 30 min. Preparar e aquecer media chapeamento (ver Tabela 1). Eutanásia: Realizar uma injeção IP de cetamina / xilazina. Esperar 10-15 minutos e verificar se há falta de córnea e pedal reflexos de retirada. Uma vez que os reflexos estão ausentes, execute uma injeção de pentobarbital IC (FatalPlus). Tenda a pele do abdômen. Corte através da pele e camadas musculares para expor a cavidade abdominal. Localize o útero e retirá-la no colo do útero e ovários. Remoção dos embriões do útero com uma tesoura e coloque-os imediatamente em L15 quente. (Todos os seguintes procedimentos sejam concluídos em um microscópio de dissecação e embriões e os cabos devem ser dissecados submerso em L15 quente em todos os momentos.) Decapite os embriões fechando forceps em torno do queixo e abaixo do osso occipital do crânio. 7. Dissecção 3 Coloque o embrião de um lado. Proteger a medula espinhal com um conjunto de pinças enquanto usa o outro conjunto para descascar afastado membros e órgãos abdominais. Vire o embrião e mantê-lo firme com um conjunto de fórceps. Snip ao longo do comprimento do embrião, do pescoço à cauda, até que o cabo inteiro é exposto. Segure a extremidade do cabo com cuidado e puxe-o sobre si mesmo para a cauda para remover. O cabo vai puxar livre com membrana e gânglios da raiz dorsal (DRG) em anexo. Se DRG explante ou cultura dissociada neurônio sensorial é a ser executada, o DRG snip fora o cabo e transferi-los para um prato de doce L15 quente. DRG para a cultura de explantes, pule para o passo 10,2 Para a cultura neurônio sensorial dissociada, pule para o passo 9 Para motor a cultura de neurônios, o DRG serão removidos com a membrana no passo 7,5 Remover a membrana da medula espinhal, segurando-o na extremidade superior da medula e peeling-lo para baixo, semelhante ao de remover uma meia longa. Repita o procedimento para todos os embriões e depois cortar as cordas em pequenos (2-3 mm) peças. <pclass = "jove_title"> 8. Motor Neuron (MN) Processamento 5,6,7 Despeje os cabos cortados e L15 em um cone, girando em 1000 RPM por 2-3 min para agregar as peças. Deitar fora o sobrenadante e adicionar 3 mL de tripsina para os cabos peletizada. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 20 min. Adicionar 3 mL FBS a cônica e girar a 1000 RPM por 2-3 min para re-pellet. Deitar fora o sobrenadante e casaco de um incêndio polido Pasteur pipeta com FBS. Adicionar uma pipeta Pasteur cheio de L15 para a cônica e depois triturar delicadamente até obter uma solução homogênea, sem grumos visíveis. Evitar bolhas. Prepare uma solução de 9% do Optiprep em L15. Prepare um tubo com 3 mL da solução Optiprep para cada dois embriões (se houver um número ímpar de embriões, arredondar para cima). Gota a solução homogeneizada para a solução Optiprep, dividindo-o igualmente entre todos os tubos. Girar os tubos a 2000 RPM por 15 min. Recolher com cuidado o topo 2 mL de cada tubo e piscina em um 50 mL cônico. Preencher o cônico com L15 e girar a 1000 RPM por 5 minutos para enxaguar as células do Optiprep. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender as células em uma pequena quantidade de media chapeamento (250-500 mL). Contar as células usando a exclusão de tripan azul para identificar as células vivas. Pule para o passo 10,1 9. Sensoriais Neuron Processing (SN) 7 Despeje o DRG removido da medula espinhal e L15 em um tubo cônico e giram a 1000 RPM por 2-3 min para agregar as peças. Deitar fora o sobrenadante e adicionar 3 mL de tripsina ao DRG peletizada. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 10 min. Adicionar 3 mL FBS a cônica e girar a 1000 RPM por 2-3 min para re-pellet. Deitar fora o sobrenadante e casaco de um incêndio polido Pasteur pipeta com FBS. Adicionar uma pipeta Pasteur cheio de L15 para a cônica e depois triturar delicadamente até obter uma solução homogênea, sem grumos visíveis. Evitar bolhas. Girar o homogeneizado a 1000 RPM por 5 min. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender as células em uma pequena quantidade de media plating SN (250-500 mL). Contar as células usando a exclusão de tripan azul para identificar as células vivas. Continue até a etapa 10,1 10. Revestimento e Cultura Para SN dissociados ou cultura MN: Cobrir os substratos com algumas gotas de mídia em seguida, adicione um volume adequado de suspensão celular. Células dissociadas devem ser banhados com uma densidade baixa (25-50 células / mm 2). Permitir que as células a aderir, pelo menos, uma hora antes de inundar os poços com a mídia. DRG para a cultura de explantes: Cobrir os substratos com algumas gotas de mídia em seguida, adicione DRG para a mídia. Organizar o DRG para que eles estão uniformemente distribuídas em todo o substrato (aproximadamente 4 DRG vai caber em um pedaço 22×22 mm capa). Permitir que o DRG para aderir por pelo menos 4 horas antes da inundação dos poços com a mídia. Culturas pode ser mantido por até 4 dias sem mudança de mídia. Para culturas mais, as mudanças meia media deve ser feito com alimentação de mídia. Alimentação de mídia é a mesma composição que media plating menos a L-glutamina. 11. Imunocitoquímica 1,5,8 Fixação células: media Aspirar e substituir com calorosa PFA 4% (paraformaldeído) por 30 min. Em seguida, executar 3X 5 min lava 1x PBS. Bloqueio / permeabilização: Prepare bloco / perm solução (1,25% de soro albumina bovina em 1X PBS, 0,05% Triton X-100 e 2,0% de soro de cabra normal). Aspirar PBS e aplicar bloco / perm solução para amostras por 30 minutos. Em seguida, executar 1X 5 min lava 1x PBS. Anticorpo primário: Prepare a solução de anticorpo primário de trabalho (10% soro de cabra normal, 1,25% albumina sérica bovina, 0,1% Na azida, 0,05% Triton X-100 mL e 10 com 1x PBS). Adicionar a quantidade adequada do anticorpo primário (ver Tabela 2). Linha de vários pratos com parafilme. Coloque uma gota 200μl de solução de anticorpo primário sobre o parafilme para cada substrato. Inverter os substratos, flutuando-los lado célula para baixo sobre a solução de anticorpo primário trabalhando durante a noite (se o quarto tem ar condicionado ou particularmente seco, um pedaço de papel saturado de água pode ser adicionada a um canto do prato para evitar a evaporação da solução de trabalho) . Anticorpo secundário: Remove os substratos do primário (a solução de trabalho podem ser recolhidos, armazenados a 4 ° C e reutilizados) e realizar 2X 5 min lava 1x PBS. Aplicar 200 mL de anticorpo secundário diluído 1:200 em PBS (também invertida em parafilme prato forrado) por 4 horas. Retire do secundário em seguida, executar 2X 5 min lava 1x PBS. Substratos de montagem em lâminas com Prolong ouro contendo DAPI ou outro contador adequado nuclear mancha. 12. Resultados representativos: A morfologia típica de alinhados e el aleatóriaectrospun fibras são mostrados na Figura 1. Nós normalmente obter MN pureza> 90% 7,8 neurônios com este protocolo e mantivemos DRG culturas durante o tempo que uma semana sem qualquer crescimento de fibroblastos significativa. A Figura 2 mostra a aparência típica MN em vidro e fibras após 24 horas de cultura e imunomarcação. DRG imunocoradas cultivados por três dias em vidro e fibras são representadas na Figura 3. Figura alinhamento Fiber 1. É manipulado por escolha de colecionador. A.) Alinhados fibras fiadas em um coletor roda girando e B.) fibras aleatórias girou em um coletor placa estacionária. Barra de escala = 20 mM. Figura 2. Neurônios motores Representante coradas para TuJ1 (verde) e DAPI (azul) após 24 horas de cultura na A. revestido PLL) fibras e B.) de vidro. Barra de escala = 20 mM. Figura 3. Manchada Representante DRG para neurofilamento (verde) após 3 dias de cultura em PLL A. revestido) de vidro e B.) fibras. Barra de escala = 200 mM. Solução estoque: MN mídia: DRG / SN mídia: 10 mg mL -1 de albumina 12,5 mL – 10 mg mL -1 apo-transferrina 50 ul 40 mL 50 mg mL -1 β-estradiol 2,7 mL 2,2 mL 0,1 mg mL -1 biotina 50 ul – 16 mg mL -1 catalase 8 mL – 15 mg mL -1 D-galactose 50 ul – 50 mg mL -1 hidrocortisona 3,7 mL 2,9 mL 0,63 mg mL -1 progesterona 0,5 mL – 16 mg mL -1 putrescina 50 ul – 50 mg mL -1 de selênio 3,4 mL 4,1 mL 2,5 mg mL -1 superóxido dismutase 50 ul – * 500 ng mL -1 fator de crescimento neural – 1 mL * 100X PSN 0,5 mL 0,5 mL * B27 1 mL 1 mL * 2 mM L-glutamina 35 mL 35 mL * Neurobasal a 50 mL a 50 mL Tabela 1. Adicionar asterisco (*) componentes para a mídia pouco antes de usar. Os demais componentes podem ser preparados como solução estoque e mantido a -20 ° C até ser necessário 6,7. Primário (concentração) Neurônios: Glia: Fibroblastos: anti-β-tubulina (TuJ1) (1:1000) ✓ X X anti-neurofilamento (1:1000) ✓ X X anti-S-100 (1:250) X ✓ ✓ anti-NGFR p75 (1:500) ✓ ✓ X Tabela 2. A seleção do anticorpo primário depende dos objetivos do pesquisador. O acima são vários anticorpos e as concentrações que temos utilizado com sucesso em nosso laboratório. S-100 é particularmente útil para identificar as células de Schwann e / ou verificar se há contaminação fibroblastos, mas note que ele deve ser usado em combinação com NGFR p75 distinguir entre glia e fibroblasts4. Temos notado também que NGFR p75 manchas neurites muito levemente, enquanto neurofilamento ou TuJ1 são excelentes opções, se o objetivo é visualizar neurites individual.