Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina
Summary
Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.
Abstract
Os primeiros passos na visão dos vertebrados ocorrem quando a luz estimula a bastonetes e cones da retina 1. Essas informações são então segregados em que são conhecidas como as vias de ON e OFF. A informação do sinal fotorreceptores de luz para as células bipolares (BCs), que despolarizar em resposta ao aumento (On BCs) ou diminui (Off BCs) na intensidade da luz. Essa segregação da informação luz é mantido no nível das células ganglionares da retina (RGCs), que têm dendritos estratificação em qualquer sublamina o Off da camada plexiforme interna (IPL), onde recebem entrada excitatória direta de Off BCs, ou estratificação em o sublamina On do IPL, onde recebem entrada excitatória direta de On BCs. Essa segregação de informações sobre aumentos ou diminuições de iluminação (a On e Off caminhos) é conservada e sinalizada para o cérebro em paralelo.
O RGCs são as células de saída da retina, e são, portanto, uma célula importante para o estudo, a fim de entender como a informação de luz é um sinal para os núcleos visuais no cérebro. Avanços da genética do rato nas últimas décadas resultaram em uma variedade de linhas repórter fluorescente mouse onde populações específicas RGC são rotulados com uma proteína fluorescente para permitir a identificação de subtipos RGC 2 3 4 e específicas destinadas para gravação eletrofisiológico. Aqui, apresentamos um método para a gravação respostas luz de células ganglionares fluorescente etiquetado em um intacto, isolado de retina. Esta preparação isolada da retina permite gravações de RGCs onde o arbor dendríticas está intacta e as entradas em todo o arbor dendríticas toda RGC são preservadas. Este método é aplicável em uma variedade de subtipos de células ganglionares e é passível de uma grande variedade de uma única célula técnicas fisiológicas.
Protocol
Discussion
Esta técnica é aplicável a qualquer gravações ganglionares da retina de células a partir de uma retina isolada. Embora na linha do rato usado acima intrinsecamente fotossensíveis, melanopsina expressando RGCs são rotulados com EGFP 2, 5, este protocolo é facilmente transferível para outros fluorescente etiquetado linhas RGC ou pode ser generalizada para gravar a partir de RGCs selecionados aleatoriamente também. Esta técnica é particularmente valioso porque o arbor dendríticas de cada RGC e seus…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por concessões do NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Agradecemos a Darwin Pendure a assistência técnica.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ames’ Medium | Sigma | A1420 | ||
| Collagenase | Whorthington Biochemical | LS005273 | ||
| Hyaluronidase | Whorthington Biochemical | LS002592 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | ||
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | ||
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | ||
| Electrodes | Sutter Instruments | BF120-69-10 | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | ||
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | ||
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
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