Indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella Lino

1. Crescita di lino in condizioni che inducono. 5 "vasi sono pieni di terreno e rassodata. Tre semi per vaso sono piantati ¼ di pollice profondo e il terreno confermato sopra i semi. I vasi vengono poi innaffiato con 100 ml di soluzioni appropriate nutrienti La mancata induzione di controllo (C) le condizioni di utilizzare una forza 1 / 10 di Miracle-Gro ogni settimana. La condizione di alta nutrienti (NPK trattamento) aveva Miracle Grow piena forza applicata settimanale. Povero di nutrienti – piante solo acqua del rubinetto fosse applicata in tutta la loro crescita. (Durrant 1971, Cullis 1980). Le piante sono coltivate in presenza di luce naturale durante l'estate. Durante l'inverno sono cresciuti sotto le luci di sodio con un 16 / 8 ore ciclo luce / buio. Ad intervalli settimanali foglie e meristemi sono raccolti. Il materiale vegetale è veloce congelati in azoto liquido. Risultati I tre genotipi crescere a tassi differenti rispetto a seconda delle condizioni (Figura 1). Pertanto in condizioni di controllare la linea Pl cresce meglio con L essendo più vigoroso di S (Figura 1a). Sotto nutrienti bassa (acqua), S cresce meglio L o Pl (Figura 1b). Sotto nutrienti alta (NPK) L cresce meglio di Pl che cresce solo di poco migliore di S (Figura 1c). Un confronto tra ciascuna delle linee cresciuti sotto i tre trattamenti diversi è illustrato nella figura 1 d – f. Pl cresce meglio in condizioni di controllo (Figura 1d), L migliori sotto nutrienti alta (figura 1e) e S in modo simile in entrambe le sostanze nutritive elevate e condizioni di controllo (Figura 1f). Questi dati dimostrano che le tre linee possono essere differenziate in base alla loro crescita sotto i tre ambienti. Di nota è che Pl cresce meglio nelle condizioni di controllo, mentre L cresce meglio nelle condizioni di NPK (alle quali è stata indotta). S cresce di circa lo stesso in tutte e tre le condizioni, cioè, non è in grado di approfittare delle migliori condizioni di nutrienti, ma è meglio in grado di crescere in condizioni di nutrienti molto bassi. I parametri di crescita che sono rilevanti per la differenziazione delle piante includono l'altezza della pianta (e associati a questo la lunghezza internodo, cioè la distanza tra ogni foglia), le dimensioni delle foglie e il grado di ramificazione. Per Pl in condizioni di controllare l'impianto è alto con rami e le foglie sono verdi grandi e scuri. Sotto nutrienti bassa l'impianto è molto breve, la distanza tra ogni foglia è anche molto breve e le foglie sono verdi piccoli e leggeri. Le foglie in punta sono più scuri di quelli verdi più in basso lo stelo. Sotto nutrienti alta la pianta sembra molto simile a quella in condizioni di controllo, tranne che sia il fusto principale e germogli laterali sono più corti negli impianti di controllo. Per la genotroph grandi le piante sembrano molto simili a quelle di Pl, tranne che la crescita più vigorosa in meno di sostanze nutritive elevate. Ancora una volta sotto i nutrienti a basso la pianta è molto breve e ha foglie verde chiaro. Il genotroph S cresce in modo simile in tutti e tre gli ambienti, anche se le foglie sono verde più chiaro sotto i nutrienti contenuti. Tuttavia, in condizioni di scarsa nutrienti la genotroph S è molto più vigorosa rispetto ad entrambi i Pl o linee L. 2. Estrazioni di RNA e DNA da meristemi di lino e le foglie sono fatte separatamente. La Roche RNA totale di preparazione kit è stato utilizzato per le estrazioni di RNA e DNA Qiagen DNeasy impianto di preparazione kit è stato utilizzato per l'estrazione del DNA. Estrazione di RNA 3 meristemi, più alcune foglie circostanti sono spostati da provetta Microbank ™ stoccaggio nel tubo eppendorf e messo in azoto liquido fino al momento di essere a terra. Sabbia sterile viene aggiunto al tubo e il tessuto è a terra con una multa fino a micropestle. 400 lisi ul / buffer vincolante da Roche RNA totale di preparazione kit è aggiunto e il tessuto è ulteriore terreno fino a quando non sono visibili grumi. Campione è in agitazione per 15 secondi per aiutare lisi e poi filata per 1 minuto a 13.000 giri per raccogliere sabbia e detriti. Surnatante si aggiunge a girare colonna e il resto della preparazione RNA istruzioni del kit sono seguite le istruzioni. DNAsi trattamento 1 / 10 del volume campione di RNA di 10X tampone DNAsi è aggiunto. 30 unità di DNAsi si aggiunge e la reazione viene incubata a 37 ° C per 30 min e 70 ° C per 5 min. Trascrizione inversa Applied Biosystems RNA a cDNA kit è utilizzato secondo le istruzioni, la reazione di incubazione a 37 ° C per 1 ora e 95 ° C per 5 minuti. Il cDNA viene poi utilizzato in PCR o per qPCR qPCR qPCR è stata effettuata utilizzando un passaggio ABI Un unico sistema. Tutti i test sono stati eseguiti in triplicato a ogni esecuzione. Il gene actina è stata usata come controllo, come numero di copiela migliore gene housekeeping disponibili. La coppia di primer appropriato è stato aggiunto ad ogni provetta in 1ml. Il cDNA è stato diluito alla concentrazione appropriata e 9μl aggiunto ad ogni provetta 10μl del Potere 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) e 'stato aggiunto ad ogni provetta Il programma di amplificazione programma è stato: 10 minuti a 95 ° C 40 cicli di 15 sec a 95 ° C, 1 min a 60 ° C Denaturazione termica passo per verificare la specificità di amplificazione I livelli di espressione relativi sono stati determinati dal valore di 2 (CTunknown – CTactin). Estrazione del DNA Buffer AP1 da impianto Qiagen DNeasy DNA preparazione kit è aggiunto 6 foglie con sabbia sterile in una provetta per microcentrifuga. Il tessuto è a terra con micropestle grumi fino a quando non sono visibili. Le istruzioni del kit sono seguite le istruzioni. Risultati Amplificazione PCR dal DNA isolato dalle foglie in diverse posizioni lungo il fusto dimostra che la comparsa di LIS-1 si verifica durante le piante crescono in condizioni che inducono (4). I risultati qPCR mostrano che la presenza di LIS-1 (o altre variazioni genomiche associate alla induzione) influenza l'espressione dei geni nelle immediate vicinanze della LIS-1 (Figura 2). I sei geni mostrato nella Figura 2 sono differenzialmente espressi in Pl e S quattro di essi avevano l'espressione più alta in PL (senza LIS-1) e due che hanno maggiore espressione in S (che ha LIS-1). Pannello 1 e 2 sono i due geni più vicino al punto di inserimento di LIS-1. L'espressione di questi geni s in genotroph di grandi dimensioni (che ha avuto cambiamenti indotti, ma non ha LIS-1) e l'espressione in condizioni di crescita diversi saranno necessari per determinare una relazione causale tra LIS-1 e le variazioni di espressione. Figura 1. Pl, L e S cresciuto sotto tre diversi regimi di nutrienti. Pannelli a – controllo, b – nutrienti bassa e c – NPK. d – Pl, e – S, f – L. Pannelli d – f da sinistra a destra: nutrienti basso, controllo e NPK. D – Pl, e – L, F – S. Figura 2. Espressione genica attorno al punto di inserimento di LIS-1. Gene 1 (inibitore di crescita) è immediatamente 5 'di LIS1 e il gene 2 (Kip legate ciclina-dipendente id inibitore della chinasi 3 "della LIS-1. I geni altre sono tutte lungo la stessa impalcatura (~ 500kb) costruito dal sequenza completa del genoma di lino. Si prega di cliccare qui per vedere una figura più grande . Figura 3. Amplificazioni PCR di DNA estratto dalle foglie di piante singole di Stormont Cirrus coltivate in condizioni di scarsa nutrienti. I prodotti di PCR sono stati separati su un 2% di agarosio TBE-gel. Il sito uninserted è mostrato in un pannello, le due estremità del sito inseriti sono mostrati in pannelli B e C. I campioni di foglie 1-6 sono stati isolati a intervalli settimanali con il campione 1 è il primo dopo la semina.