פרוטוקול: פרופיל איזוטופים יציבים של מטבוליזם הביניים במהלך C. elegans פיתוח על צלחות NGM. * הערה: להעשרת איזוטופ יציב ניתן למדוד בהצלחה אוכלוסיות נמטודות צעיר מבוגר בעקבות חשיפת איזוטופ (עם גלוקוז או 13 אוניברסלית שכותרתו C או 1,6 – 13 C 2-גלוקוז) מתחיל או בהתפתחות המוקדמת או בבגרות המוקדמת. פרוטוקול זה מאפשר ניטור במקביל של בריאות בעלי חיים, התפתחות, צמיחה צמיחה נמטודות על תקן התקשורת (NGM) צלחות, אשר אינה מושגת בקלות בתרבות נוזל. הכינו מנות 100 מ"מ פטרי עם 10 מ"ל של התקשורת צמיחה נמטודות (NGM), לכל טכניקה תקן 1. NGM צלחות מורחים עם OP50 E. coli 1 ולאפשר לו להתייבש במשך הלילה. הוספת 500 μL של 200 מ"מ 1.6 – 13 ג'2 גלוקוז (להשיג ריכוז סופי של 10 מ"מ בצלחת NGM) אחיד לצלחת. לייבוש למשך הלילה. Bleach הרה להולדת מבוגר תולעים 1. פלייט התאוששה ביצים על צלחות NGM ללא חיידקים או 1,6 – 13 ג'2 גלוקוז. לדגור על 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, להעביר בקעו, L1-נעצר הזחלים לצלחות NGM להפיץ בעבר עם 1,6 – 13 C-2 גלוקוז OP50 E. coli (לכל צעד מס '2, לעיל). לגדל תולעים לשלב הבוגרים הצעירים (48-72 שעות, תלוי מתח), תולעים נטילת טיפול לא לגווע ברעב. איסוף סינכרוני, היום הראשון תולעים בוגרות צעירות צלחות עם 3-4 מ"ל של Basal ס. לשטוף תולעים 50 מ"ל של Basal ס ב 50 צינורות מ"ל פלקון. אפשר תולעים גלולה על ידי כוח המשיכה במשך 5 דקות. הסר supernatant כדי מ"ל 5 ~. חזור על לשטוף פעמיים נוספות. אומדן מספר התולעת על ידי ספירת three 100 aliquots μL 2. התאם את הריכוז כדי תולעת תולעים 1000 / mL של הבסיס ס. פיפטה 1 מ"ל (1000 תולעים) לתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל צנטריפוגות. הוסף 69 μL של 60% PCA המכיל פנימי סטנדרטי (ε-aminocaproic חומצה) לריכוז סופי של PCA 4% ו 200 μmol של תקן פנימי. בואו תולעים ליישב על ידי x הכבידה 5 דקות. הסר ולשמור את supernatant בצינור אחר. טוחנים בעזרת דגימות תולעת פלסטיק homogenizer (Kontes גלולה העלי) ו מקדח ממונע (מנוע Kontes גלולה העלי אלחוטי) למשך 15 שניות. ראייה לאשר שיבוש תולעת על ידי מיקרוסקופ אור. חזור במידת הצורך. מעבירים את supernatant משלב # 11 לשלב עם homogenate משלב # 12. צנטריפוגה מדגם ב 2250 סל"ד (1300 XG) במשך 5 דקות. העברת supernatant אל צינור טרי 7 מ"ל זכוכית. שמור גלולה עבור assay ריכוז חלבון, כמפורט צעד # 20, להלן. דגימות ה-pH טווח (ניטראלי) 7-8 באמצעות 4N KOH. צנטריפוגה דגימות לנטרל בצינור זכוכית 7 מ"ל ב 2250 סל"ד (1300 XG) במשך 5 דקות כדי להסיר מלחים. העברת supernatant אל צינור טרי 7 מ"ל זכוכית. הכינו דגימות לנטרל עבור quantitation המטבוליט על ידי: ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה (HPLC): μL נפרדת 50 מדגם לנטרל עבור הזרקה ישירה לתוך HPLC. חומצת אמינו חינם quantitation מבוצע על ידי HPLC (וריאן) באמצעות טרום טור derivatization עם זיהוי O-phthalaldehyde ו ניאון, כפי שתואר לעיל 3-4. גז כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה (GC / MS): המשך מיצוי של דגימות לנטרל הנותרים באמצעות חילוף יונים שרף (Bio-Rad) להגדרה GC / MS העשרת איזוטופים של חומצות אמינו וחומצות אורגניות, כמפורט בפרוטוקול ד הוסף 1 מ"ל של NaOH 1N לחלבון גלולה הנותרים (משלב # 15) שפופרת זכוכית 7 מ"ל. דגירה NaOH שטופלו מדגם חלבונים בטמפרטורת החדר תוך כדי סיבוב (Labnet * Rotator LabRoller) לילה עד שהיא נמסה. השתמש 75-100 μL של חלבון NaOH שטופלו כדי לקבוע ריכוז חלבון על ידי שיטות סטנדרטיות (Assay DC חלבון, Bio-rad). פרוטוקול ב 'פרופיל איזוטופים יציבים של חילוף החומרים ביניים ב C. elegans צעירים בתרבות נוזל. * הערה: תופעות תרופתי על השטף מתווך מטבולית נמטודות מבוגר ניתן ללמוד בעקבות תחילת החשיפה איזוטופי ביום הראשון של ההטלה או על צלחות NGM (ראה פרוטוקול, לעיל) או בתרבות נוזל. אנו מעדיפים את הגישה השנייה על מנת למקסם את יעילות העלות של איזוטופ יציב וניצול תרופתי סוכן. מדולל סינכרוני, ביום הראשון ההטלה צעירים ב ס הבסיס מכיל כולסטרול 0.0005% (מתקבל על ידי הוספת 0.5 מ"ל של כולסטרול 1% (מומס אתנול 95%) עד 1 ליטר ש בסל) עד 2000 בעלי חיים לכל μL 500. הגדרת ~ 4 תרבות מ"ל הנפח הכולל (ים) ב 25 צלוחיות מ"ל Erlenmeyer, כדלקמן: טיפול: NONE "סם" ס בסל עם כולסטרול 3020 μL 3020 UL – "תרופות" נפח איזוטופ יציב (1,6 – 13 C 2-גלוקוז) 80 μL 80 μL K12 E. coli (OD 660 2.5-3) 400 μL 400 μL למבוגרים תולעים יאנג (2000) 500 μL 500 μL והתרופות (הריכוז הרצוי) – כפי הרצוי מכסים ברדיד צלוחיות. Shake צלוחיות במשך 24 שעות בכל סל"ד 220 ב 20 ° C מודגרות פלטפורמה שייקר. ודא צלוחיות לא אטום לחלוטין, כמו חמצן נדרשת עבור השטף מטבולית מתווך ועל וכתוצאה תיוג של מטבוליטים נמטודות אנדוגני. לשטוף תולעים על ידי הוספת 4 תרבות נפח מ"ל ל 46 מ"ל של הבסיס ס בצינור מ"ל 50 חרוטי פלסטיק. אפשר תולעים גלולה על ידי כוח המשיכה במשך 5 דקות. אבק supernatant אל ~ 5 מ"ל נשאר יניקה. חזור על לשטוף על ידי מילוי צינור פעמיים יותר 50 מ"ל עם הבסיס ס. תתרכז תולעים שטף עד 1000 תולעים / mL של צינור פלסטיק 1.5 מ"ל צנטריפוגות. הוסף 69 μL של חומצה perchloric 60% (PCA) ו – 2 μL של 10 מיקרומטר פנימי סטנדרטי (ε-aminocaproic חומצה) כדי להשיג ריכוז סופי של תקן 200 μmol פנימית PCA לבין 4%. הכינו דגימות כמו לכל הצעדים # 11-22 בפרוטוקול א PROTOCOL-C-1. ניטור ניצול איזוטופי של תולעים בוגרות על צלחות על ידי התחקות שכותרתו פחמן דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה מומס. * הערה: בעוד הפרוטוקולים ושיטות B פרט לפקח ההתאגדות איזוטופ לתוך מטבוליטים חינם בתוך תולעים במשך 2-3 ימים של התפתחות או 1 יום של החיים הבוגרים, בהתאמה, אישור ברוטו של ההצלחה קינטיקה ההתאגדות איזוטופי במשך זמן קצר (כלומר, דקות עד שעות) ניתן להשיג על ידי תווית ניטור דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה (CO 2) שוחרר מן תולעים או הכלול פחמן דו חמצני מומס בתוך לחלץ תולעת. חיידקים חיים או נהרגו יכול להיות מוזן על תולעים כאשר גדל על צלחות (פרוטוקול C-1). חיידקים אין צורך בחשיפה לטווח קצר איזוטופ של תולעים בתרבות נוזלי (פרוטוקול C-2). הכינו מנות 100 מ"מ פטרי עם 10 מ"ל של אגר NGM. מורחים צלחות NGM עם או לחיות או UV-נהרגה OP50 E. coli (כפי שמודגם באיור 1). אפשר צלחות לייבוש למשך הלילה. הוספת 500 μL של 200 מ"מ 1,6 שכותרתו-13 C-2 גלוקוז אל OP50 NGM צלחות התפשטות (ריכוז האיזוטופ הסופי של 10 מ"מ בצלחת NGM). אפשר צלחות לייבוש למשך הלילה. השג סינכרוני, ביום הראשון ההטלה, תולעים בוגרות צעיר גדל על צלחות אגר NGM להפיץ רק עם OP50 E. coli. העברת 1,000 תולעים בוגרות צעירות ניסיוני צלחות אגר NGM המכיל איזוטופ יציב וא coli (מוכן כמו לכל הצעדים # 1-2, לעיל). NGM ניסיוני צלחת מניחים (ללא כיסוי) בתא זכוכית אישית מצויד שסתום 3 כיווני אטום היטב כדי לאפשר דגימה האווירה החלפת מדויק. מיד לתאי חותם עם דיסק זכוכית שקוף אופטית. כיסוי תפר שבו זכוכית הדיסק יושב על צלחת עם גריז ואקום גבוה כדי לאטום. שיא הזמן "0 Time". 10 מ"ל לדוגמה האווירה מתא הזכוכית על ידי שסתום 3-way עם מזרק 20 מ"ל ב 30 דקות, 60, 90 ו – 120. העברת כל מדגם אטמוספרי כדי פקק מוכנה מראש גומי 10 מ"ל עקף שפופרת זכוכית המכילה 1 מ"ל של 1 mM NaHCO 3 ב 0.1 N NaOH כי כבר נחתם בוואקום. הזרק 10 מ"ל של הגב אוויר לתוך תא הזכוכית בכל דרך שסתום 3 דרך באמצעות מזרק 20 מ"ל. סגור שסתום אל החדר לאחר דגימה / reinjecting האווירה לפני חידוש הדגירה בין נקודות הזמן האוסף. להזריק 100 μL של חומצה זרחתית 20% דרך הפקק לתוך פקק גומי 10 מ"ל עקף שפופרת זכוכית המכילה מדגם CO 2 באטמוספרה. הסר 2 מ"ל של האווירה להזריק אותו לתוך 12 מ"ל כחול העליון אוטומטי סמפלר צינורות מראש מלא הליום למדידת CO 2 באטמוספרה. ניתוח "באטמוספירה CO 2 דוגמאות" על ידי גז יחס ספקטרומטר מסה (ThermoQuest פיניגן דלתא פלוס). זכוכית חדרי פתח בעקבות שני תקופת דגירה איזוטופ שעה אוסף של כל דגימות אטמוספרי. לשטוף תולעים מצלחות NGM באמצעות 3 מ"ל של הבסיס ס. לשטוף תולעים הבסיס 50 ס מ"ל 50 מ"ל צינורות פלקון. חזור על לשטוף פעמיים נוספות. תתרכז תולעים ~ 1000 תולעים / mL בצינור 7 מסביב לתחתית הכוס מ"ל (ים). חותם אבק צינור זכוכית עם פקק גומי. הוספת 100 μLשל חומצה זרחתית 20% באמצעות פקק גומי עם מזרק לשחרר מומס CO 2. הסר 2 מ"ל של האווירה להזריק לתוך 12 מ"ל כחול העליון אוטומטי סמפלר צינורות מראש מלא הליום למדידת CO 2 מומס. ניתוח "מומס CO 2 דוגמאות" על ידי ספקטרומטר גז יחס המוניים (ThermoQuest פיניגן דלתא פלוס). אלטרנטיבי Protocol (C-2): ניצול ניטור איזוטופי של תולעים בוגרות בתרבות נוזלי על ידי התחקות שכותרתו פחמן דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה מומס. השג סינכרוני, תחילה ההטלה יום, צעיר מבוגר תולעים גדל על צלחות אגר NGM התפשטות עם OP50 E. coli. לשטוף תולעים 50 מ"ל של הבסיס ס ב 50 צינורות מ"ל פלקון. אפשר תולעים גלולה על ידי כוח המשיכה במשך 5 דקות. הסר supernatant כדי מ"ל 5 ~. חזור רוחץ פעמיים נוספות. העברת 1,000 תולעים בוגרות צעירות הבסיס ש 1 מ"ל ל 10 צינור עגול התחתונה מ"ל זכוכית. הוסף μl 10.1 ממניות M 1 מתוך אוניברסלית שכותרתו 13 C-הגלוקוז 1 מ"ל של תולעים כדי להשיג את הריכוז הסופי של 10 מ"מ. חמצן סביב תחתית זכוכית צינור שהכיל תולעים איזוטופ ידי החלפת האווירה זורם עם 100% חמצן בצינור פתוח במשך 2 דקות. מיד לסגור צינור עם פקק גומי. Shake צינורות ניסיוני 20 ° C מודגרות פלטפורמה שייקר ב 220 סל"ד. שיא החל זמן כמו "0 Time". 5 לדוגמה מ"ל של האטמוספירה מהצינור 10 מ"ל מסביב לתחתית הכוס באמצעות מזרק 10 מ"ל ו – 25 מחט מד באמצעות פקק גומי דקות 30, 60, 90 ו – 120. העברת כל מדגם אטמוספרי כדי פקק, מוכנה מראש גומי מצופה זכוכית 10 מ"ל שפופרת המכילה 1 מ"ל של 1 mM NaHCO 3 ב 0.1 N NaOH כי כבר נחתם בוואקום. הזרק 5 מ"ל של אוויר לתוך הצינור בחזרה בכל סיבוב התחתונה ניסיוני זכוכית המכיל תולעים איזוטופ באמצעות פקק גומי באמצעות מזרק 10 מ"ל ו – 25 מחט מד. קורות חיים הדגירה של הניסוי 10 מ"ל מסביב לתחתית צינורות זכוכית המכיל תולעים איזוטופ ידי רועדת על 220 סל"ד בין נקודות הזמן האוסף. להזריק 100 μL של חומצה זרחתית 20% באמצעות פקק לאטמוספרה המכילה פקק גומי עקף 10 מ"ל שפופרת זכוכית. הסר 2 מ"ל של האווירה להזריק לתוך 12 מ"ל כחול העליון אוטומטי סמפלר צינורות מראש מלא הליום למדידת CO 2 באטמוספרה. ניתוח "באטמוספירה CO 2 דוגמאות" על ידי גז יחס ספקטרומטר מסה (ThermoQuest פיניגן דלתא פלוס). בתום תקופת הניסוי, לשטוף תולעים הבסיס 50 ס מ"ל בשפופרת פלקון 50 מ"ל. אפשר ליצור תולעת גלולה על ידי כוח הכבידה. אבק supernatant אל ~ 5 מ"ל נשאר יניקה. חזור על לשטוף את ידי פעמיים נוספות ב 50 מ"ל של הבסיס ס. תתרכז תולעים ~ 1000 תולעים / mL בצינור 7 מסביב לתחתית מ"ל זכוכית. הוסף פקק גומי חותם צינורית ואקום. הוספת 100 μL של חומצה זרחתית 20% באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 מד דרך פקק הגומי לשחרר תולעת CO 2 מומס. הסר 2 האווירה מ"ל ו להזריק לתוך 12 מ"ל כחול העליון אוטומטי סמפלר צינורות מראש מלא הליום למדידת CO 2 מומס. ניתוח "מומס CO 2 דוגמאות" על ידי ספקטרומטר גז יחס המוניים (ThermoQuest פיניגן דלתא פלוס). פרוטוקול ד עיבוד לנטרל דגימות הפרוטוקולים A ו-B עבור חומצת אמינו וניתוח חומצה אורגנית על ידי ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה / מסה. ביד אופן ההכנה: הוסף 1 N HCl לשני Ag 1 ו Ag 50 חרוזים בנפרד כוסות 1L. מוסיפים את כל בקבוק במשך 30 דקות עם stirrer מגנטי. לשטוף עם מים חרוזים deionized 10 פעמים עד pH של כביסות שווים pH של המים. טור אופן ההכנה: הוספת תוסף כותנה בדיוק מעל החלק הצר ביותר של פסטר פיפטה קצה. הוסף חרוזים טעונה לכל אחד שתי עמודות לפי המדגם, מילוי כל כ שליש גובה העמודה. השתמש AG1 חרוזים להפקת חומצה אורגנית. השתמש AG50 חרוזים להפקת חומצה אמינית. לדוגמה עיבוד: הוספת 500 μL המדגם לעמודה עם חרוזים AG1 טעונה. דבר נוסף במדגם (ראה פרוטוקול, צעד # 19B) לפני יישום לעמודה AG1 לחלץ חומצות אורגניות, אם המדגם הוא כבר ב-pH נייטרלי. הוסף 1 מ"ל של 0.1 N HCL המדגם הנותרים לפני החלת אותו טור AG50 כדי לחלץ חומצות אמינו. דוגמאות אפשר לרוץ לחלוטין באמצעות עמודות. לשטוף עם מים עמודה 10 פעמים עד כביסות ניטרליים (7-8 טווח ה-pH). Elute עמודות טריים, שכותרתו 4 צלוחיות זכוכית מ"ל מדגם: להפקת חומצה אורגנית, להוסיף 3mL של 3 N HCl לעמודה AG1. זה מאפשר ניתוח של העשרה איזוטופ במספר הכולל של פחמנים שכותרתו בין 3-פחמן מינים (לקטט), 4-פחמן מינים (aspartate, succinate, Malate)5 פחמן מינים (גלוטמט), ו -6 פחמן מינים (ציטראט). להפקת חומצות אמינו: להוסיף 3mL של 4 N NH 4 OH לעמודה AG50. זה מאפשר ניתוח של העשרה איזוטופ במספר הכולל של פחמנים שכותרתו בין 3-פחמן מינים (אלאנין) ו -5 פחמן מינים (גלוטמין). מניחים את בקבוקוני לדוגמה Reacti-VAP III המאייד לילה עד יבש. א Derivitization לדוגמה והגדרות מכונת עבור המוניים ספקטרומטריית הוסף 50 μL של אצטוניטריל ו 50 μL של N-methyl-NT-butyldimethylsilyl trifluoroacetamide (MTBSTFA) כדי בקבוקון כל המדגם. מכסים, מערבבים דגירה במשך 30 דקות על 60 ° C. הזרק 1-2 μl לדגימה לתוך ספקטרומטר גז כרומטוגרפיה / המוניים (GC / MS). פ ניתוח של תוצאות כימות של פסגות חומצת אמינו. Quantitation של חומצת אמינו זו על ידי ניתוח HPLC מחושב לפי השטח היחסי של כל אחד השיא לזה של התקן פנימי. חישוב העשרת איזוטופים. העשרת איזוטופים יציבים מחושב ב-Excel (Microsoft) עבור כל מין על פי הנוסחה הבאה: אחוז עודף Atom, תיקן (APE) = (R SA-R רח') * 100 / [(R SA-R רח') 100], כאשר R SA – יחס המדגם רחוב R – יחס של תקן. הערכת הבדלים סטטיסטיים בין העשרה מדגם. הסטודנטים של t-מבחן משמש כדי להעריך את המשמעות של חומצת אמינו יחסית הבדלים בתווית איזוטופי בין דגימות. נציג תוצאות: איזוטופ יציב היטב שולבו תולעים בוגרות צעירות, כפי שמעידים פחמן שכותרתו נמדד באטמוספירה CO 2 ו-CO 2 מומס תולעת. בשנת תולעים נמאס או חי או UV-מוקרן נהרגו OP50 E. coli, יחס של 13 CO CO פבואר 02-12 היה גדול יותר ב-CO 2 חלקיק מומס תולעת יחסית ל-CO 2 באטמוספרה שוחרר (איור 1). תולעים האכלה לחיות או הרג OP50 E. coli לא לשנות באופן משמעותי הנמדד 13 2-12 CO-CO 2 יחס בתמצית תולעת שטף (ראה פרוטוקול C1). חשיפה ממושכת איזוטופ יציב מתקופת הזחל מוקדם גדל העשרת איזוטופים של מטבוליטים מתווך. תיקון אטומים עודף אחוז פחמן שכותרתו נקבע מטבוליטים מתווך של wild-type תולעים צעירים למבוגרים היה גדול על פני כל מיני תולעים גלוטמט כאשר הואכלו אוניברסלית שכותרתו 13 C-גלוקוז חיידקים חיים בכל התפתחות ביחס חיות שטופלו באופן דומה נמאס חיידקים שכותרתו עבור 48 שעות בלבד לאחר שהגיע ההטלה בשלב הבוגר (איור 2). השפעת ניקוי פעמים על העשרת איזוטופים. ללא קשר timecourse חשיפה, כל בעלי החיים גדלו על הצלחות היו "פינה" של התווית איזוטופי לפני הכנת במורד הזרם עבור GC / MS מנתח. השוואה של פרוטוקולי הסליקה בוצעה כפי שמוצג באיור 2, כולל האכלה תולעים עבור 2 שעות על צלחות אגר NGM עם התפשטות חיידקים טריים לחיות בלי איזוטופ או האכלה על צלחות אגר NGM ללא חיידקים למשך 2 שעות, האכלה על צלחות אגר NGM ללא חיידקים או 2 או 6 שעות. ללא קשר, כמובן, החשיפה איזוטופי, אין הבדל משמעותי העשרת איזוטופים של מטבוליטים מתווך מתמצית התולעת הבוגרת צעיר שלם נצפתה כאשר החיות פונו על צלחות ללא חיידקים או 2 או 6 שעות. לעומת זאת, העשרת איזוטופים פחות נצפתה מטבוליטים מתווך כאשר החיות היו לאחר מכן "פינה" של איזוטופ עודף האכלה על ידי חיידקים ללא תווית במשך שעתיים. עם זאת, גדל העשרה 3, 4, ו 5 מינים ניכרה כאשר תולעים נחשפו איזוטופ מתקופת הזחל מוקדם. לפיכך, פרוטוקול ניקוי אופטימלי היה נחוש בדעתו להיות ניקוי תולעים הבאים הדגירה שלהם על צלחות NGM התפשטות חיידקים עם איזוטופ יציב על ידי הדגירה לאחר מכן עבור 2 שעות על צלחות NGM unspread. ראוי לציין, תולעים גדל בתרבות נוזל נשטפו ברורה של התווית חיידקים איזוטופי בשלושה כרכים של הבסיס ס (ראה פרוטוקול B); GC / MS וניתוח של כביסות לא הראו העשרה איזוטופי משמעותי על ידי לשטוף השלישי. תולעת שחיקה הניב העשרה מירבית של מטבוליטים מתווך. כדי למטב את העשרה אחוז מטבוליטים מתווך התנאים הבאים לטיפול דומה, נעשתה השוואה של דגימות תולעת מופרת על ידי sonication לבד או sonication בתוספת טחינה. איור 3 מראה כי תולעים שיבשו חשיפה איזוטופ הבאים על ידי sonication בתוספת טחינה היה העשרת איזוטופים יותר דגימות מופרת רק על ידי sonication. נתונים אלה מראים כי שברים יותר משנה האורגניזם שובשו על ידי שחיקה מאשר sonication. מחקרים מאוחרים יותר גילו שחיקה לבד בלי sonicatio n היה די כדי להשיג את העשרת איזוטופים מקסימלי (מידע לא מוצג). חשיפה תולעת שלמים איזוטופי היתרי ניתוח של השתנות ביניים מסלול מטבולי. האכלה עם תולעים חיים מבשר איזוטופים יציבים או במהלך הפיתוח (פרוטוקול, תרשים 4 א) או בתחילת בחיות בשלב הבוגר (פרוטוקול ב ', תרשים 4 ב) אישורים ניתוח רגישות של העשרת איזוטופים בין מטבוליטים מעיד על השטף דרך הגליקוליזה (לקטט, אלאנין), pyruvate חילוף החומרים (אלאנין), ואת מחזור חומצה tricarboxylic (ציטראט, Malate, succinate, aspartate, גלוטמט, גלוטמין ו). אוניברסלי שכותרתו 13 C-הגלוקוז מספק תיוג חזקים של כל מיני פחמן, בעוד הניצול של 1,6 – 13 C-2 גלוקוז היתרי תיוג חזקים רק 1 מינים של כל המטבוליט. טכניקה זו יכולה להבחין בהבדלים ברגישות של wild-type השטף מתווך תולעת מטבולית בקרב המיטוכונדריה שרשרת הנשימה זנים מוטנטים, כגון מורכבות III שרשרת הנשימה במיטוכונדריה למקטע מוטציה isp-1 (qm150). איור 5 מדגים את סדר הגודל של ההבדלים שנצפו תווית מוחלטת בין isp-1 (qm150) ותולעים N2 כל חשוף במשך 24 שעות 1,6 – 13 C-2 גלוקוז בתרבות נוזל עם K12 E. חיידקים קולי מהיום הראשון של ההטלה שלב הבוגרים הצעירים (פרוטוקול B). מחקרים נוספים איזוטופים יציבים בטווח של תולעים מוטציה במיטוכונדריה נמצאים בעיצומם. באיור 1. אוניברסלי שכותרתו 13 C-גלוקוז איזוטופ יציב היה טוב שולבו תולעים בוגרות צעירות 13 CO 2: 12. CO 2 יחס (אטומים עודף אחוזים (APE), תיקן) ב wild-type (N2) תולעים הבאים שעתיים האכלה אוניברסלית- שכותרתו 13 C-גלוקוז או UV-נהרגו או לחיות OP50 חיידקים על צלחות (פרוטוקול C1). C 13 הכללתו מטבוליטים התולעת היתה איתנה לאחר שעתיים של חשיפה איזוטופ. ברים כחול ואדום עולה העשרת איזוטופים יחסית בשלב גז ("באטמוספירה CO 2") לבין שלב נוזלי ("תולעת CO 2"), בהתאמה. איור 2. חשיפה ממושכת איזוטופ מתקופת הזחל מוקדם ומאוחר "ניקוי" תולעים על צלחות אגר NGM ללא חיידקים גדל העשרת איזוטופים של גלוטמט ללא תולעים בוגרות צעירות. העשרת איזוטופים במינים גלוטמט מוצג עבור תולעים שניזונו NGM צלחות אגר עם אוניברסלית שכותרתו- 13 C-גלוקוז OP50 חיידקים או במהלך הפיתוח משלב L1 הזחל דרך שלב 959 מבוגרים צעירים תאים ("L1", ראה פרוטוקול), או ארבעים ושמונה שעות לאחר תחילת תולעים הגיע היום הראשון של ההטלה צעיר בשלב הבוגר ("יא"). ציר ה-X מציין את המספר הכולל של אטומי פחמן מסומן בכל מיני גלוטמט. ציר Y מציין את העשרה אחוז (אטומים מתוקן לכל עודף (APE)). ברים ירוק עולה תולעים פינה חשיפה איזוטופ הבאים על ידי האכלה OP50 E. coli ללא איזוטופ על צלחות NGM שעתיים לפני מיצוי PCA. ברים כחול ואפור מצביעים תולעים פינה חשיפה איזוטופ הבאים על צלחות NGM ללא חיידקים או איזוטופ עבור שתיים או שש שעות, בהתאמה, לפני מיצוי PCA. איור 3. שיבוש תולעים על ידי שחיקה התשואות העשרת איזוטופים מקסימלי של מטבוליטים תולעת מתווך. העשרה אחוז הפחמן נמדד 1 מינים ציטראט ב wild-type תולעים שטופלו במשך 24 שעות בתרבות נוזל עם 1,6 – 13 C-2 גלוקוז ללא חיידקים (פרוטוקול B). בארים שחור ואפור מצביעים ותולעים שובשו על ידי sonication בלבד או על ידי sonication וטחינה, בהתאמה. העשרת איזוטופים הבאים חשיפה 1,6 – 13 C-2 גלוקוז מוערך ביותר מטבוליטים שכותרתו על פחמן אחד. לעומת זאת, התווית מועשר בכל מיני כל המטבוליט כאשר אוניברסלית שכותרתו-13 C-גלוקוז מנוצל. איור 4. תוצאות נציג להמחיש את היקף העשרת איזוטופים של מתווך מטבוליטים תולעת מעיד על השטף דרך הגליקוליזה, מטבוליזם pyruvate, ואת מחזור חומצה tricarboxylic. מתוקן אטומים עודף אחוזים (APE) נקבע צעיר wild-type מבוגר (N2 בריסטול) תולעים הבאים 1, 6-13 C-2 גלוקוז או חשיפה (א) במהלך הפיתוח משלב L1 על צלחות (פרוטוקול), או (ב) החל ביום הראשון של ההטלה כבוגרים צעירים למשך 24 שעות בתרבות נוזלי (פרוטוקול B) . ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן שבו נתונים איזוטופי אמין משלושה ביולוגי משכפל היה זמין. <p class= "Jove_content"> איור 5. Quantitation מוחלט חומצת אמינו של מינים חומצת אמינו מטבוליט של wild-type ו המיטוכונדריה זנים התולעת מוטציה. התווית מוחלט לכל מין של ארבע חומצות אמינו היה מחושב על ידי הכפלת HPLC שנקבע ריכוז חומצת אמינו חופשית (nmol / מ"ג חלבון תולעת) על ידי עודף אטומים תיקן אחוזים (APE) עבור כל מין. ברים אפור ושחור מעידים wild-type (N2 בריסטול) ו המיטוכונדריה זני מורכב III למקטע מוטציה (ISP-1 (qm150)), בהתאמה. ברים לציין ממוצע של שלושה ניסויים ביולוגיים לשכפל לכל זן.