Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução
Summary
Este protocolo descreve um método confiável para anestesiados e de imagem de intacta<em> Drosophila melanogaster</emLarvas>. Temos utilizado o anestésico volátil desflurano para permitir imagens repetitivas na sub-celular de resolução e re-identificação de estruturas para até poucos dias<sup> 1</sup>.
Abstract
Recentes melhorias na imagem óptica, fluoróforos geneticamente codificados e ferramentas genéticas que permite criação eficiente de linhas desejado animal transgênico permitiram processos biológicos a ser estudada no contexto de uma vida, e em alguns casos, mesmo comportando, organismo. Neste protocolo, vamos descrever como para anestesiar as larvas Drosophila intactas, utilizando o anestésico volátil desflurano, para acompanhar o desenvolvimento e plasticidade sináptica das populações a nível sub-celular Resolução 03/01. Enquanto outros métodos úteis para anestesiar Drosophila melanogaster larvas foram descritos anteriormente 4,5,6,7,8, o protocolo aqui apresentado demonstra melhorias significativas devido ao seguinte combinado principais características: (1) Um grau muito elevado de anestesiados, mesmo os batimento cardíaco é preso permitindo a resolução lateral de até 150 nm 1, (2) uma elevada taxa de sobrevivência de> 90% por ciclo anestesiados, que permitem a gravação de mais de cinco pontos temporais durante um período de horas ou dias 2 e ( 3) uma alta sensibilidade permitindo-nos em duas instâncias para estudar a dinâmica de proteínas expressas em níveis fisiológicos. No detalhe, nós fomos capazes de visualizar a subunidade do receptor pós-sináptico de glutamato GluR-IIA expressas por meio do promotor endógeno 1 em linhagens transgênicas e estável da linha de armadilha exon FasII GFP-1. (4) Em contraste com outros métodos 4,7 larvas pode ser trabalhada não apenas vivo, mas também intactos (ou seja, não dissecado), permitindo a observação de ocorrer ao longo de vários dias 1. Os detalhes de vídeo que acompanha a função de partes individuais do in vivo de imagens da câmara 2,3, a correta montagem das larvas, o procedimento anestesiados, como re-identificação de posições específicas dentro de uma larva ea remoção segura das larvas a partir da imagem câmara.
Protocol
Discussion
O método apresentado foi desenvolvido inicialmente para estudar sinapses glutamatérgicas sobre os músculos do corpo muro de Drosophila melanogaster larvas. A Drosophila junção neuromuscular (MNJ) é caracterizada por um estereótipo cito-arquitetura dos músculos e neurônios e é, portanto, ideal para a imagem in vivo. No entanto, o protocolo descrito anestesiados não se limita à imagem do MNJ; a transparência de larvas de Drosophila facilita a adaptação do protocolo descrito para estudar o desenvolvimento de órgãos, a migração de células, transporte de carga axonal e sub-celular de reorganização dentro das células.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Andreas Schönle, Max Plank Institute, para Química Biofísica, Alemanha e David J. Sandstrom, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA, para assessoria técnica. Agradecemos a Frank Kötting, European Neuroscience Institute, Göttingen para a construção da câmara de imagem eo dispositivo anestesiados. Este trabalho foi financiado por concessões do Forschung Alzheimer Iniciativa para TMRYZ foi apoiado por uma bolsa da China Scholarship Conselho, SBH por uma bolsa de estudos da Escola de Pós-Graduação em Neurociência Celular e Molecular, Universidade de Tübingen.
Materials
Reagents:
- Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germany)
- Halocarbon oil (e.g. Voltalef H10S oil / Atofina, Puteaux, France)
- Fly culture medium
Equipment:
- Inverted confocal microscope
- Binocular microscope (e.g. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germany)
- Small paintbrush as used to sort flies
- Incubator
- Custom built imaging chamber (For mechanical drawings see Ref. 3)
- Vaporizer/anesthetization device (For details see Ref. 3)
References
- Rasse, T. M. Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo. Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).
- Rasse, T. M. . In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , (1988).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Vinegoni, C. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. J Vis Exp. , (2009).
- Lin, C. Y. Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy. Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &. a. m. p. ;. a. m. p., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
