عزل الخلايا الجذعية من الإنسان Xenografts سرطان البنكرياس

1. Xenografts الحصاد من الفئران تعد الخلية تفارق العازلة : Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) ، البنسلين ، الستربتوميسين ، 200 U / مل كولاجيناز الرابع نوع ، و 0.6 dispase يو / مليلتر. والموت الرحيم وathymic (نو + / + نو) الماوس بايواء سرطان البنكرياس الإنسان طعم أجنبي تحت الجلد التي هي أقل من 1 سم في القطر أكبر خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون والتفكك عنق الرحم. حصاد الورم تحت الجلد من الجهة من الفأرة التي تشريح حادة باستخدام ملقط ومقص ووضعها مباشرة في الخلية تفارق العازلة. يتم وزن الأورام وضعها مرة أخرى في 10 مل الخلية تفارق العازلة لكل 1 غرام من الأنسجة السرطانية. 2. إنشاء خلية واحدة تعليق من Xenografts العمل في مجال السلامة الأحيائية حكومة عقيمة ، يتم نقل الورم إلى 100 x 20 مم طبق الثقافة مع 1 مل من تفكك خلية العازلة. ومفروم ميكانيكيا الأورام باستخدام شفرات الحلاقة وملقط معقم. هو مسحوق تعليق الخلية السرطانية من خلال الماصة 5 مل المصلية 10 مرات. وينبغي أن تكون القطع ورم صغير لا يكفي ليسد الماصة 5 مل المصلية. يتم نقل الخلايا السرطانية لتعليق أنبوب 50 مل المخروطية التي تحتوي على حجم ما تبقى من الخلايا تفارق العازلة (شغل أقل من 50 ٪) وvortexed في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة. ومن ثم حضنت تعليق خلية الورم في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع vortexing متقطعة لمدة 1 دقيقة كل 20 دقيقة. 3. تستنفد تعليق خلية من خلايا الأنسجة والحطام الميت بعد حضانة 2 ساعة vortexed تعليق الخلية في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة. ثم يتم تمرير تعليق خلية من خلال فلتر 70 ميكرون ، والتي تم جمعها في أنبوب 50 مل الطازجة المخروطية وتعديلها إلى الحجم النهائي من 15 مل في أنبوب. لمزيد من الخلايا قادرة على البقاء منفصلة من الخلايا الميتة وبقايا الأنسجة ، ويتم فصل تعليق ورم الخلايا بواسطة الطرد المركزي كثافة استخدام Ficoll – Paque بلس. يتم إنشاء السفلية من Ficoll – Paque بلس من خلال pipeting 15 مل من Paque – Ficoll ببطء زائد دون تعليق الخلية والحرص على عدم الخلط بين طبقتين. ويتم طرد تعليق الخلية وطبقات في Ficoll ز 500x لمدة 30 دقيقة مع فرامل إيقاف. يتم جمع الخلايا في واجهة من زائد Ficoll – Paque والخلية العازلة تفارق ونقل إلى أنبوب 50 مل الطازجة المخروطية. DMEM جديدة تستكمل مع FCS 10 ٪ إضافة إلى تعليق الخلية لأنها تضعف 01:03 (على سبيل المثال وسائل الإعلام 20 مل جديدة تضاف إلى 10 مل من التعليق الخلية). يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في ز 450X لمدة 10 دقائق ، ووسائل الإعلام مصبوب ، وبيليه معلق الخلية في 1 مل من ALDEFLUOR العازلة. غير المخفف microliters عشرة لتعليق زنزانة مع 10 ميكرولتر التريبان الأزرق وخلايا قابلة للحياة تحسب باستخدام عدادة الكريات. إذا لاحظ عدد كبير من الخلايا الميتة أو الأنسجة الحطام خلال هذه الخطوة ، ومن ثم يمكن تكرار فصل الخلايا بواسطة الطرد المركزي الكثافة (الخطوات 3،3-3،7). 4. وصمة عار للخلايا الإسفار الفرز الخلية المنشط التسمية seven 12 × البوليسترين أنابيب الاختبار 75 ملم على النحو التالي : طاهر CD44 – APC CD24 – PE الماوس CD31 – البيوتين + الفأرة النسب ، البيوتين + ماوس H – 2Kd – البيوتين ALDEFLUOR + + ALDEFLUOR دياب مفتش 2bκ – APC + مفتش 2aκ – PE ALDEFLUOR + CD44 + CD24 – APC – PE – CD31 + ماوس + ماوس البيوتين البيوتين النسب – H – + ماوس 2Kd – البيوتين. تمييع تعليق خلية في 2 مل من العازلة ALDEFLUOR إلى تركيز النهائي من 5-10 مليون خلية / مل والحفاظ على الجليد. إضافة 100 ميكرولتر لتعليق الخلية لأنابيب # 1 ، 2 ، 3 و 4 والاحتفاظ بها على الجليد. إضافة 1 ميكرولتر دياب إلى أنبوب # 6 والحفاظ على الجليد. إضافة كاشف ALDEFLUOR إلى تعليق الخلايا المتبقية المخفف 1000 — أضعاف (مثل إضافة كاشف ALDEFLUOR 1.6 إلى 1.6 مل ميكرولتر تعليق الخلية) ، ومزيج جيد ، ومكان على الجليد. نقل 100 ميكرولتر من هذا الخليط لأنابيب # 5 و 6 ، والخليط المتبقي (1.4 مل) إلى أنبوب # 7. احتضان كل من الأنابيب في المياه 37 درجة مئوية لمدة الحمام 40 دقيقة. مزيج تعليق خلية كل 10 دقائق وذلك لمنع الخلايا من تسوية في الجزء السفلي من الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا ز 450X و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة ثم صب المخزن المؤقت. Resuspend الكريات في أنابيب # 1 و 5 في 100 العازلة ALDEFLUOR ميكرولتر. لأنابيب # 2 ، 3 ، 4 ، و 6 ، إضافة 100 ميكرولتر من ALDEFLUOR العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة المناسبة المخفف على النحو التالي : 1:20 لمفتش 2bΚ – APC ، مفتش 2aΚ – PE ، CD44 APC ، وCD24 – PEالأضداد ؛ 1:100 للماوس CD31 – البيوتين ، الفأرة النسب ، البيوتين ، والفأرة – H – 2Kd البيوتين الأضداد. إلى أنبوب # 7 إضافة 1.4 مل من ALDEFLUOR العازلة التي تحتوي على التخفيف من APC 01:20 – CD44 ، وأضداد CD24 – PE والتخفيف من الماوس 1:100 CD31 – البيوتين ، الفأرة النسب ، البيوتين ، والفأرة – H – 2Kd البيوتين الأجسام المضادة. احتضان الايقاف الخلية على الجليد لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا ز 450X و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة ثم صب المخزن المؤقت. Resuspend الكريات في أنابيب # 1 ، 2 ، 3 ، 5 ، و 6 في 100 العازلة ALDEFLUOR ميكرولتر. إعداد 1.5 مل من ALDEFLUOR العازلة التي تحتوي على التخفيف من 1:100 streptavidin – PerCP البروتين. إضافة إلى أنبوب ميكرولتر 100 # (4) وإضافة 1.4 مل إلى أنبوب # 7. احتضان الايقاف الخلية على الجليد لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا ز 450X و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة ثم صب المخزن المؤقت. Resuspend الكريات في أنابيب # 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، و 6 في 200 العازلة ALDEFLUOR ميكرولتر. Resuspend الكرية في أنبوب # 7 في 2.8 مل من ALDEFLUOR العازلة التي تحتوي على 2 ميكروغرام / مل يوديد propidium. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات. تمر الخلايا من خلال 35 ميكرون التصفية باستخدام 12 × البوليسترين أنابيب الاختبار 75 ملم مع قبعات مصفاة. 5. عزل الخلايا الجذعية السرطانية بواسطة الإسفار الفرز الخلية المنشط ويتم إعداد تدفق عداد الكريات FACSAria لفرز الخلايا. يتم وضع ضوابط التعويض باستخدام خلايا من أنابيب # 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، و 5. يتم إنشاء بوابات استنادا إلى الأمام والمعلمات الجانبية مبعثر لجمع singlets الخلية. غير الماوس (PerCP سلبية) وقابلة للحياة الخلايا (غير ملطخة يوديد propidium) هي بوابات باستخدام قناة FL – 3. يتم جمع ALDH + الخلايا استنادا البوابات التي تم إنشاؤها باستخدام الخلايا المعالجة دياب (أنبوب # 6) وFL – 1 قناة. يتم جمع CD44 CD24 + + الخلايا استنادا البوابات التي تم إنشاؤها باستخدام الخلايا ملطخة ALDEFLUOR ، مفتش 2bΚ – APC ، و IgG 2aκ – PE (أنبوب # 6) باستخدام FL – 4 وقنوات FL – 2. يتم جمع الخلايا في 12 × 75 ملم أنابيب اختبار تحتوي على البوليسترين 1 مل من DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪. بعد أن تم فرز الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي للتعليق على الخلية ز 450X لمدة 10 دقيقة ، صب وسائل الإعلام ، وresuspend الخلايا في DMEM 500 ميكرولتر جديدة تستكمل مع FCS 10 ٪. حساب عدد الخلايا فرزها باستخدام عدادة الكريات كما هو موضح في الخطوة 3.8. 6. ممثل النتائج وسوف يؤدي هذا البروتوكول إلى عزل ALDH + و + CD44 CD24 + CSCS البنكرياس. النسبة المئوية للخلايا فأر المستمدة من هو متغير ، ولكن وجدنا أن معظم xenografts الإنسان بسرطان البنكرياس تحتوي على 20-60 ٪ خلايا فأر المستمدة من استخدام الماوس CD31 ، الفأرة النسب الكوكتيل ، والفأر H – 2Kd البيوتين ، مترافق الأضداد (الشكل 1A ). وبالمثل تردد كل من السكان CSC xenografts المختلفة هو متغير ، ولكن عموما لدينا وجدت أن 1-4 ٪ من مجموع السكان الخلية هو ALDH + (الشكل 1B) و 0،2-5 ٪ هو CD44 CD24 + + (الشكل 1C). نحن عادة العد يدويا باستخدام الخلايا فرز عدادة الكريات منذ التهم غالبا ما تكون آلة FACSAria غير دقيقة بسبب عدم الكشف عن الجزيئات الخلوية من قبل FACSAria. الشكل 1. تدفق مؤامرة الخلوي تصور محدد من السكان البنكرياس سرطان طعم أجنبي (A) خلايا تلطيخ ايجابيا في القناة FL – 3 (propidium يوديد + ، CD31 ماوس الفأرة النسب + + ، أو الماوس H – 2Kd +) مستبعدة وذلك لعزل فقط غير قابل للاستمرار والفأر الخلايا المشتقة. (ب) وقد تم قياس النشاط في ALDH طعم أجنبي سرطان البنكرياس الإنسان التدفق الخلوي باستخدام كاشف ALDEFLUOR في حضور وغياب المانع ALDH1 diethylamino – بنزيلديهايد (دياب). الأطر تمثل البوابات التي تصور خلايا + ALDH التي تم إنشاؤها على أساس الخلايا تعامل مع دياب ومن ثم تطبيقها على الخلايا غير المعالجة. وتظهر النسب المئوية للخلايا + ALDH في البوابة. (C) وCD44 CD24 + + تم إنشاء بوابة على أساس الخلايا ملطخة ALDEFLUOR ، والأجسام المضادة للمفتش 2bκ – APC (التحكم عن الأنماط الإسوية APC – CD44) و IgG 2aκ – PE (التحكم عن الأنماط الإسوية PE – CD24). وتظهر النسب المئوية للخلايا CD44 CD24 + + في البوابة.