Generierung von RNA / DNA-Hybride in genomischer DNA durch Transformation mit RNA-haltigen Oligonukleotiden

Gründe Ausnutzung der Verwendung von Thermo Scientific Dharmacon Oligos, 50 bis 80-mers, hier präsentieren wir ein Verfahren, basierend auf einem Gen-Korrektur-Assay, durch die Oligos genetischen Information, um genomische DNA von Hefezellen übertragen kann, folgende Glühen, das Ziel chromosomalen DNA. Erfolgreiche Ausrichtung von Oligos ist durch das Auftreten von Hefe-Kolonien in dem die voraussichtliche Phänotyp erzielt. Wenn die gewünschte genetische Veränderung innerhalb eines oder mehrerer Ribonukleotiden in der Oligo-Sequenz eingebaut durchgeführt wird, fließt die genetische Information direkt aus der RNA-Darm-Trakt der chromosomalen Ziel-DNA, also ein RNA / DNA-Hybrid bildet bei der chromosomalen Ebene während der Targeting-Prozess. Die Ribonukleotid / s aus einem Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo kann als Vorlage für Gen-Targeting über DNA-Reparatur-Synthese dienen oder in die DNA integriert werden und dienen als Vorlage bei der DNA-Replikation. In diesen Experimenten verwenden wir die Hefe / Saccharomyces cerevisiae / eukaryotischen Modellsystem, aber einen ähnlichen Ansatz auch in anderen Organismen oder Zellen angewendet werden. In diesem Video, verwenden wir ein Thermo Scientific Dharmacon Oligo mit Homologie konzipiert, um ein Ziel Hefe genomischen Lokus und die einen Ribonukleotid in der Mitte, um eine Mutation im Zielgen zu korrigieren. Nach der Transformation mit dem RNA-haltigen Oligo beobachten wir die Korrektur der Ziel-Website bei einer bestimmten Frequenz, was bedeutet, dass die RNA-Darm-Trakt der Oligo in die chromosomale DNA konnten integriert werden und dienen als Vorlage für die DNA-Synthese während der DNA-Replikation gibt. Die genetische Information in der RNA-Darm-Trakt getragen wird stabil an die folgenden Generationen Zelle übertragen. Hier beschreiben wir die Schritte der Hefezelle Umbildung durch den Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo-und die Annäherung an die RNA Informationen übertragen in die chromosomale DNA zu erkennen. A. Aufbau der RNA-haltigen Oligo in diesem Experiment verwendet Wir haben ein RNA-haltigen Oligo um einen genetischen Defekt in der Hefe zu korrigieren konzipiert S. cerevisiae chromosomale DNA an der trp5 Locus. Der Hefestamm in das verwendete Protokoll enthält eine Mutante trp5 Gens mit einer Zwei-Basendeletion und eine Nonsense-Mutation (Abbildung 1A). Solche Hefestamm ist ein Tryptophan auxotrophen Mutante und bildet keine Kolonien auf Medien ohne Tryptophan. Die DNA-Sequenz des Gens TRP5 finden Sie auf der Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Die Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo im Sinne dieses Protokolls ist ein 65-mer mit einem 2-base DNA-Insertion, entwickelt, um die Deletionsmutation und ein Ribonukleotid entwickelt, um die Nonsense-Mutation des trp5 Allel (Abbildung 1A) richtig zu korrigieren. Die Sequenz des Oligo ist wie folgt aufgebaut: 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Diese Oligo wird von Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) bei 200 nm-Maßstab und wird entsalzt, entschützt und ohne PAGE Reinigung. B. Herstellung der RNA-haltigen Oligo für Hefe-Transformation (modifiziert nach Storici et al., 2007 1) Wischen Sie Materialien, die für das Experiment mit Oligo Röhren, Pipetten, Wirbel, Racks, experimentellen Bereich und Handschuhe von den Prüfern mit RNase Dekontaminationslösung mögliche RNase Kontamination vor alles beginnt zu entfernen getragen verwendet werden. Verwenden RNase-freies Wasser, chemische Reagenzien, Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen in allen Schritten. Jeder Schritt in diesem Experiment sollte RNase-frei sein. Resuspendieren Thermo Scientific Dharmacon RNA-haltigen Oligo erhielt von der Firma zu 250 pMol / ul Stammlösung mit RNase-freiem Wasser und kräftig vortexen, um das Pellet zu lösen. Lagerung bei -80 ° C. Unmittelbar vor der Transformation, tauen die RNA-haltigen Oligo auf Eis und verdünnter zu 50 pMol / ul mit RNase-freiem Wasser in RNase-freie Rohre. Jeder Wandel erfordert 1 nmol der RNA-haltigen Oligos. Denaturieren eine gewählte Höhe der RNA-haltigen Oligos auf dem 100 ° C Hitze-Block für 2 min zur sekundären Strukturen des Oligos zu beseitigen. Unmittelbar nach Denaturierung statt der Röhre auf dem Eis. Keep on ice bis Transformation. Als Kontrolle in dem Experiment eine entsprechende DNA-Oligo nur verwendet wird. Diese Oligo ist von -20 ° C aufgetaut und zubereitet für die Transformation als RNA-haltigen Oligo, wie oben beschrieben. C. Transformation von Hefezellen mit Hilfe der RNA-haltigen Oligo Impfen 5 ml reichen YPD-Flüssigmedium mit der trp5 mutierten Hefezellen wachsen und bei 30 ° C über Nacht (siehe Materialien). Übertragen 1,5 ml der Übernacht-Kultur in 50 ml YPD flüssigen Medium. Inkubieren von Zellen in einer 30 ° C Schüttler (225 rpm) für 4h. Bereiten Sie Lösung 1und Lösung 2 unmittelbar vor der Transformation in RNase-freie Röhrchen (siehe Materialien). Übertragen Sie die Zellkultur zu einer 50 ml RNase-freies Röhrchen und drehen sich mit 3000 rpm, das entspricht bis 1562 g, für 2 min. Das Pellet aus der Zelle Niederschlag liegt bei ca.. 0,3 cm 3. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 50 ml RNase-freies Wasser und drehen sich mit 3000 rpm für 2 min. Wiederholen Sie Schritt 6 für 5 mal loswerden das Kulturmedium und RNasen, die vorhanden sein in dem Medium so weit wie möglich könnte. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in 5 ml der Lösung 1 und Spin bei 3000 rpm für 2 min. Überstand entfernen und die Zellen in 250 ul Lösung 1. Diese Menge an Zellen reicht für 7-8 Transformationen. Aliquot 50 pl der Zellsuspension in RNase-freien Reaktionsgefäßen, fügen Sie 20 ul RNA-haltigen Oligo funktionierende Lösung (1 nmol) oder 20 ul DNA-Oligo nur funktionierende Lösung (1 nmol) oder 20 ul sterilem Wasser ohne Oligo für die negative Kontrolle. Dann fügen Sie 300 ul Lösung 2 für jede Transformation Reaktion. Es gibt keine Notwendigkeit, Lachs-Sperma-DNA in den Prozess der Transformation hinzu, wie die Oligos fungieren als Träger selber. Vortex kräftig zu mischen Komponenten homogen. Inkubieren Transformation Reaktionen bei 30 ° C für 30 min in einem Shaker. Hitzeschock bei 42 ° C für 15 min. Spin down Zellen bei 5000 rpm, das entspricht 2236 g, für 4 min. Überstand entfernen und die Zellen in 100 ul sterilem Wasser. Nehmen Sie ein Aliquot dieser Zellsuspension und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser von 100.000-fache und Platte-Zellen auf einer YPD Platte mit ca.. 15 sterile Glasperlen und Inkubieren bei 30 ° C für 2 Tage. Platte aller resuspendierten Zellen aus jeder Transformation Reaktion auf eine Petrischale aus Kunststoff komplette festen Medium ohne Tryptophan (SC-Trp) mit ca.. 15 sterile Glasperlen und Inkubieren bei 30 ° C für 4-5 Tage (Abbildung 2). D. Analyse von Gen-Korrektur durch die RNA-haltigen Oligo Zählt die Anzahl der Kolonien auf der selektiven Medium (Abbildung 2) sowie auf YPD-Medium, das Gen-Korrektur-Frequenz für den RNA-haltigen Oligo berechnen, die DNA-only Oligo-und für die no-Oligo-Steuerung. Vergleichen Sie die Nummer erhalten. Spontane Rückkehr von der trp5 Allele mit dem Zwei-Basendeletionen und die Nonsense-Mutation ist weniger als 10-9 in den verwendeten Hefestamm, so erwarten wir keine Kolonien Bildung auf der selektiven Medium, wenn keine Oligos zu den Zellen hinzu. Streak aus mehreren zufällig ausgewählten Transformante Kolonien auf YPD-Medium, um einzelne Kolonie isoliert zu erhalten. Warten Sie zwei Tage für Koloniewachstum, dann nehmen Sie mehrere (mindestens 5) einzelne Kolonien und machen Flecken auf YPD und auf selektivem Medium. Entwerfen Sie ein Paar von Primern für die Region (250-1.000 bp) durch die RNA-haltigen Oligo durch Kolonie-PCR (Abbildung 1B) gezielt zu verstärken. Das Verfahren für die Kolonie-PCR ist wie folgt (modifiziert nach Storici und Resnick, 2006 2). Die Zellen (ca. 1 mm3) aus den einzelnen Patches in 50 ul Wasser aufgenommen und fügen Sie 1 Einheit des Lyticase. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min, durch Inkubation in einem Heizblock folgte bei 100 ° C für 5 min zu den Zellen und Freisetzung genomische DNA in Lösung zu brechen. PCR-Bedingungen: Die PCR-Reaktion umfasst 10 ul der Zelle Resuspension, 50 pmol jedes von Vorwärts-und Rückwärts-Primer, 1 ul 10 mM dNTPs, 1 Einheit Taq-Polymerase, 5 ul 10x Puffer und mit sterilem Wasser bis zu einer eingestellten Endvolumen von 50 ul durchgeführt. Das PCR-Programm wird 3 min bei 95 ° C, 30 Zyklen von 30 s bei 95 ° C, 30 s bei 55 ° C und 1 min bei 72 ° C, eine letzte Verlängerung der Zeit von 7 Minuten bei 72 ° C, dann Proben werden bei 4 ° C gehalten Eine Verlängerung der Zeit von 1 min / kb ist für diese Reaktion angenommen. Nach PCR werden die Proben auf einem 1% oder 2% (in Abhängigkeit von der erwarteten Größe des PCR-Produkts) Agarosegel für die Beobachtung des PCR-Produkts (Abbildung 3) ausgeführt werden. Wenn die genetische Information von der RNA-haltigen Oligo übertragen erzeugt eine neue Restriktionsschnittstelle in der Hefe genomischen Zielregion (Abbildung 1B), ist es möglich, die korrekte Übermittlung von Informationen durch Verdau des PCR-Produkts mit dem entsprechenden Restriktionsenzym zu überprüfen. Wenn keine Restriktionsschnittstelle durch die RNA-haltigen Oligo erzeugt wird, gehen Sie zu Schritt 6 weiter. Digest PCR-Produkte mit einem bestimmten Restriktionsenzym. Die Abbaureaktion umfasst 6 ul PCR-Produkt, Puffer, BSA (nicht benötigt für einige Enzyme, siehe Anleitung für das Enzym verwendet werden), 0,5 ul Restriktionsenzym und sterilem Wasser auf 15 ul. Die Proben werden für 1 h bei der Temperatur spezifisch für das verwendete Enzym inkubiert. Führen Sie eine unverdaute Probe zusammen mit dem verdauten Proben auf der gleichen Zeile einer 2% igen Agarosegel zubeobachten die genetische Veränderung durch die RNA-Darm-Trakt des RNA-haltigen Oligo (Abbildung 3) übertragen. Purify PCR-Produkte durch Verwendung eines PCR-Purification Kit und bereiten sie für die DNA-Sequenzierung. Submit Proben für die Sequenzierung mit dem gleichen Primer verwendet, um ein Produkt zu verstärken. Analysieren Sie die DNA-Sequenzierung Ergebnisse mit Software, die Ausrichtung von mehreren Sequenzen mit einer ausgewählten Referenz-Sequenz (Abbildung 4) ermöglicht. E. Alkalibehandlung der RNA-haltigen Oligo (Abbildung 5) Für jede Reaktion add 1 nmol (4 ul von 250 pMol / ul Stammlösung) der RNA-haltigen Oligo-oder DNA-Oligo in ein 1,5 ml-Tube. Add 4 ul 1 M NaOH für die Hydrolyse, oder alternativ add 4 ul H 2 O als negative Kontrolle, und inkubieren Sie bei 65 ° C im Wasserbad für 1 h Dann aus dem Wasserbad, um Eis zu bewegen. Neutralisieren mit 2 ul von 1,2 M HCl, 4 ul 1 M Tris-HCl und 4 ul H 2 O, oder alternativ 6 ul H 2 O und 4 ul 1 M Tris-HCl für negative Kontrolle. Keep on ice bis Transformation. Abbildung 1. Schematische Darstellung des defekten trp5 Gens und des TRP5 Allel durch die RNA-haltigen Oligo korrigiert. A) Die trp5 mutierte Gen enthält einen 2-base-Deletion (schwarze Dreiecke) und 1-Basis Nonsense-Mutation (Stern). Die einsträngige RNA-haltigen Oligo mit 2-base Insertion (blaue Schleife) und 1-RNA Basenaustausch (rotes Rechteck) Erzeugen eines Van91 ich Restriktionsenzymstelle (dargestellt durch die Klammer) wird in Hefezellen transformiert, um die genetische Defekte zu korrigieren der trp5 Gen. B) Nach dem TRP5 Gen durch die RNA-haltigen Oligo (korrigiert Basen sind als blaue Rechtecke gekennzeichnet) repariert wird, ist die Van91 I-Stelle in die TRP5 Gen erzeugt. A 278 bp-Fragment mit nur einem Van91 I Restriktionsschnittstelle in TRP5 Gen PCR durch ein Paar von Primern (P1 und P2) verstärkt. Die 177 bp und 101 bp Fragmente nach Aufschluss der P1-und P2-PCR-Produkt von Van91 generiert I sind ebenfalls dargestellt. Abbildung 2. Transformation Ergebnis mit der RNA-haltigen Oligo. A) Hefezellen ohne Oligo verwandelt bilden keine Kolonie auf dem SC-Trp Medium, siehe Platten ab. B) Die Platten cg zeigen Hefekolonien wachsen auf SC-Trp nach Zellen mit 1 nmol der RNA-haltigen Oligo umgewandelt. C) Platten hl zeigen Hefekolonien wachsen auf SC-Trp nach Zellen mit 1 nmol der entsprechenden DNA-only Kontrolle Oligo umgewandelt. Abbildung 3. Detektion von genetischen Information Transfer vom RNA-haltigen Oligo Hefe chromosomale DNA durch Restriktionsverdau des PCR-Produktes verstärkt die gezielte genomischen Region. 2% Agarosegelelektrophorese von PCR-Proben, die durch P1 und P2 verstärkt und verdaut mit Van91 I Restriktionsenzym. Spuren 1, 8 und 15, DNA-Leiter mit Größen von 100, 200, 300, 400 und 500 bp angegeben auf der linken Seite; Spur 2, PCR-Produkt von trp5 locus von der genomischen DNA des trp5 Mutante verstärkt; Spur 3, PCR Produkt aus genomischer DNA aus einer Trp + Kolonie durch die DNA-Oligo nur gezielt abgeleitet verstärkt, Spur 9 bis 14, Van91 I Restriktionsverdau, Spur 4-7, PCR-Produkte von genomischer DNA aus Trp +-Kolonien durch die RNA-haltigen Oligo gezielt abgeleitet verstärkt der PCR-Produkte von Bahnen 2 bis 7. Die Präsenz der uncut-PCR-Produkt-Bands in den Bahnen 10 bis 14 können durch partielle Verdauung durch Van91 ich am TRP5 Locus (CCACATTCTGG) erläutert. In Anbetracht, dass die Schneiden Website für Van91 I (CCANNNN NTGG) können mehrere Sequenzen haben, kann die Seite in TRP5 erzeugt nicht die optimale Ziel für das Enzym. In der Tat, nach DNA-Sequenzierung aller oben genannten PCR Produkte, die wir erkennen keine weiteren Änderungen über die von der Oligos durchgeführt (siehe Abbildung 4). Die 278 bp PCR-Bande von P1 und P2-Primer und die Verdauung Produkt-Banden durch Van91 verstärkt I von 177 bp und 101 bp sind durch die Pfeile auf der rechten Seite angezeigt. Abbildung 4. DNA-Sequenzierung Ergebnisse zeigen Gen-Korrektur durch die RNA-haltigen Oligo. A) DNA Elektropherogramm der genomischen Region des RNA-haltigen Oligo ausgerichtet. Das G in der DNA-Sequenz (blau boxed) leitet sich von der RG auf der RNA-haltigen Oligo. Auch boxed ist das Einsetzen der CG Basen. Sequencing Ergebnisse aus allen anderen PCR-Produkte werden auch als clear wie dieses, mit fluoreszierenden Signale weit über dem Hintergrund. B) Sequenzen der TRP5 Region des Trp + Transformanten durch die DNA-only Oligo (T1) und der RNA-haltigen Oligo (T2-T5) entsprechen in der Konsensus-Sequenz auf dem Gipfel zielgerichtet und sind mit denen der trp5 mutierten Zellen im Vergleich vor Targeting durch die Oligos (Genomic DNA, rot schattiert). Die Reparatur-RNA-haltigen Oligo auf der Unterseite hat zwei-base DNA-Insertion und einer-base (G) RNA-Substitution in rot markiert. Die Regionen boxed in blau mit gelben Farbton zeigen, dass die RNA-haltigen Oligo sowie die DNA-Oligo nur präzise korrigiert die Deletionsmutation und Nonsense-Mutation in allen getesteten Proben. Die gestrichelten Linien markieren die Position des RNA-haltigen Oligo-Sequenz. Abbildung 5. Alkalibehandlung verhindert Gen Korrektur durch den RNA-haltigen Oligo. Die Transformation Frequenz durch die RNA-haltigen Oligo (R) in den roten Balken, und dass durch die DNA-only Oligo (D) ist in den blauen Balken angezeigt wird angezeigt. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes für 3 unabhängige Transformationen für jedes Oligo. Die DNA-only Oligo zeigt ähnliche Transformation Frequenz ohne und mit NaOH-Behandlung. Anders fällt Transformation Frequenz durch die RNA-haltigen Oligo auf 0 nach der Behandlung mit NaOH. Daher ist die Vorbereitung mit der RNA-haltigen Oligo nicht mit DNA-Oligo nur verunreinigt, so ist die beobachtete Umwandlung Frequenz spezifisch für den RNA-haltigen Oligo.