سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين
Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصوير ثلاثي الأبعاد ميكرون النطاق للتركيز الأوكسجين في البيئة المباشرة من الخلايا الحية التي تدور الإلكترونات المجهري الرنين.
Abstract
يصف هذا البروتوكول الرنين الالكتروني المغناطيسي (ESR) الصغيرة التصوير طريقة لرسم خرائط ثلاثية الابعاد لمستويات الأوكسجين في البيئة المباشرة من الخلايا الحية مع ميكرون على نطاق القرار 1. الأوكسجين هي واحدة من الجزيئات الأكثر أهمية في دورة الحياة. وهو بمثابة محطة المتقبلة الإلكترون الفسفرة المؤكسدة في الميتوكوندريا ، ويستخدم في إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية. قياسات الأكسجين هامة لدراسة وظائف الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي ، مما يشير الممرات ، وآثار مختلف المحفزات ، نفاذية الغشاء ، وتمايز المرض. استهلاك الأوكسجين وبالتالي علامة بالمعلومات الأيض الخلوي ، والتي تنطبق على نطاق واسع لمختلف النظم البيولوجية من الميتوكوندريا إلى خلايا للكائنات كلها. نظرا لأهميتها ، وقد وضعت العديد من الأساليب لقياس الأوكسجين في الأنظمة الحية. وتستند المحاولات الجارية لتوفير مستوى عال من الدقة التصوير الأكسجين بشكل رئيسي على مضان البصرية وأساليب تفسفر التي تفشل في تقديم نتائج مرضية كما أنها توظف تحقيقات مع ارتفاع السمية الصورة وحساسية منخفضة الأوكسجين. ومن المعروف ESR ، والذي يقيس إشارة من تحقيقات ممغطس الخارجية في العينة ، لتوفير قياسات دقيقة للغاية من تركيز الأوكسجين. في حالة نموذجية ، والقياسات ESR خريطة توسيع المسبار lineshape و / أو الاسترخاء في الوقت تقصير التي ترتبط مباشرة إلى تركيز الأوكسجين المحلية. (الأوكسجين ممغطس ، وبالتالي ، عندما يصطدم مع التحقيق ممغطس الخارجية ، فإنه ضيق أوقات الاسترخاء والخمسين.) تقليديا ، يتم تنفيذ هذا النوع من التجارب كان خارجا مع القرار منخفضة ، ملليمتر النطاق ESR للتصوير الحيوانات الصغيرة. هنا نبين كيف يمكن أيضا أن يكون التصوير ESR التي نفذت في الحجم ميكرون لفحص عينات حية صغيرة. ESR الدقيقة التصوير منهجية جديدة نسبيا ، والتي تمكن من الحصول على اشارات ESR مكانيا حل مع قرار يقترب 1 ميكرون في درجة حرارة الغرفة 2. الهدف الرئيسي من هذه الورقة هو بروتوكول لاظهار كيف ان هذه الطريقة الجديدة ، جنبا إلى جنب مع مجسات حساسة للأكسجين المطورة حديثا ، يمكن تطبيقها على رسم خرائط لمستويات الأكسجين في عينات حية صغيرة. قرار المكاني لل~ 30 × 30 × 100 ويتجلى ميكرون ، مع قرب micromolar تركيز الأوكسجين حساسية ودون حساسية فيمتومول الأكسجين المطلق لكل فوكسل. استخدام ESR الدقيقة لرسم الخرائط والتصوير بالقرب من الخلايا الأوكسجين يكمل التقنيات المتوفرة حاليا على أساس الدقيقة الأقطاب أو مضان / تفسفر. علاوة على ذلك ، مع التحقيق ممغطس السليم ، سيكون أيضا ينطبق بسهولة لتصوير الخلايا المجهرية الأكسجين ، والقدرة التي تجد وسائل أخرى من الصعب جدا تحقيقه.
Protocol
Discussion
هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن تطبيقها ESR التصوير الجزئي لتعيين تركيز الأكسجين بالقرب من عينات صغيرة حية. قرار المكاني لل~ 30 × 30 × 100 ويتجلى ميكرون ، مع قرب micromolar تركيز الأوكسجين حساسية ودون حساسية فيمتومول الأكسجين المطلق لكل فوكسل. استخدام ESR الدقيقة لرسم الخرائط والتصوير بالقرب من الخلايا الأوكسجين يكمل التقنيات المتوفرة حاليا على أساس الدقيقة الأقطاب أو مضان / تفسفر. علاوة على ذلك ، مع التحقيق ممغطس السليم ، فإنه يمكن تطبيقه بسهولة لتصوير الخلايا المجهرية الأكسجين ، وقدرة وسائل أخرى والتي تجد من الصعب جدا تحقيقه. في المستقبل القريب نخطط لزيادة تحسين هذه المنهجية لتقديم عينة من الصور الحية مع قرار من بضعة ميكرونات ، وتوفير معلمات النقيض من مثل تركيز أكسيد عظمى والحموضة (PH) ، نشر وتحقيق معامل ، بالطبع ، وتركيز الأوكسجين. هذه القدرات هي مكملة لمنهجيات البصرية الحالي القائم على حد سواء من حيث النوع ، وكذلك على النقيض من خصائص العينات (مثل عينات غير شفافة وسميكة ، في بعض الحالات ، مقابل قياسات الخلايا خارج الخلية).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Centrifuge | Kendro | Heraus, 75003235 | ||
| Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical | Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6. | |||
| BG-11 buffer | For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. | |||
| Syringe | Hamilton | Microliter 7000.5 | ||
| Ultraviolet Curing | Norland Products, Inc. | NOA63, or NOA61. |
References
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance. Biophysical Journal. , (2010).
- Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications. J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).
- Gallez, B., Swartz, H. M. In vivo EPR: when, how and why?. NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. . EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).
- Matsumoto, S. Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).
- Talmon, Y. Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE. ESR. J Phys Chem. , (2010).
- Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy. Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).
- Allen, M. M., Stanier, R. Y. Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae. J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).
- Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance. Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).
