في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية
Summary
electroporation في الرحم هو وسيلة قيمة لtransfecting الخلايا الاصلية العصبية في الجسم الحي. تبعا للوضع الأقطاب وtimepoint التنموية للelectroporation ، يمكن استهداف مجموعات فرعية معينة من الخلايا القشرية. ويمكن بعد ذلك أن تحلل الخلايا المستهدفة في الجسم الحي أو في المختبر لآثار التغير الجيني.
Abstract
الدراسة في المختبر من الثقافات العصبية الأولية يسمح لتحليلات كمية من ثمرة neurite. من أجل دراسة كيفية تغيرات جينية تؤثر على الخلايا العصبية ثمرة عملية ، أو يمكن shRNA قدم يبني [كدنا] في الخلايا العصبية الأولية عن طريق ترنسفكأيشن الكيميائية أو تنبيغ الفيروسية. ومع ذلك ، مع الخلايا القشرية الأولية ، هي transfected مجموعة غير متجانسة من أنواع الخلايا (الخلايا العصبية glutamatergic من طبقات مختلفة ، والخلايا العصبية المثبطة والخلايا الدبقية) باستخدام هذه الأساليب. استخدام electroporation في الرحم لإدخال الحمض النووي يبني في القشرة القوارض الجنينية يسمح لمجموعات فرعية معينة من الخلايا لتكون مستهدفة : في حين electroporation الجنينية المبكرة من القشرة أهداف الطبقات العميقة من القشرة ، electroporation في أواخر timepoints الجنينية أهداف طبقات أكثر سطحية. مزيد من موضع الفرق من الأقطاب الكهربائية عبر رؤساء نتائج الأجنة الفردية في استهداف المناطق الظهري البطني الإنسي مقابل الاطراف من القشرة. electroporation التالية ، يمكن تشريح الخلايا transfected الخروج ، فصل ، ومطلية في المختبر للتحليل الكمي لثمرة neurite. هنا ، ونحن نقدم أسلوب خطوة بخطوة لقياس الكمي العصبية ثمرة عملية في مجموعات فرعية من الخلايا القشرية.
وقد وصفت البروتوكول الأساسي للفي الرحم electroporation بالتفصيل في مقالين إن الرب الأخرى من المختبر Kriegstein 1 و 2. سوف نقدم لمحة عامة عن بروتوكول لدينا في الرحم electroporation ، مع التركيز على أهم التفاصيل ، يليه وصفا لدينا بروتوكول أن ينطبق في electroporation الرحم لدراسة وظائف الجينات في عملية نمو الخلايا العصبية.
Protocol
Discussion
الدراسة في المختبر من الثقافات العصبية الأولية تسمح للتحليلات كمية من ثمرة neurite. من أجل دراسة كيفية تغيرات جينية تؤثر على الخلايا العصبية ثمرة عملية ، يمكن عرض أو shRNA misexpression يبني في الخلايا العصبية الأولية عن طريق ترنسفكأيشن الكيميائية أو تنبيغ الفيروسية. ومع ذ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جوزيف LoTurco Selkoe ودينيس لإجراء مناقشات مفيدة حول هذه التقنية. المؤلفان بالشكر إلى الجهات المانحة لمساعدة مؤسسة الصحة الاميركية ، لدعم هذه البحوث.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
References
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
