Совместное культивирование клеток до н.э.: Культивирование раковых клеток молочной железы с фрагментами костей для изучения распространения раковых клеток

1. Совместное культивирование раковых клеток молочной железы, прилегающих к фрагментам костей для измерения распространения клеток молочной железы с помощью BLI

1. Перед экспериментом подготовьтесь к суспензии, содержащей 2^{х 10 5} раковых клеток молочной железы/50 мкл, и подготовите вилки костного воска для обездвиживания фрагментов костей в культуре. Вырезать P200 микропипет отзыв на 3 части и использовать узкий конец крупнейшего куска в "куки резак" образом, чтобы сократить небольшие (35 мг) кусочки костного воска. Используйте широкий конец самой маленькой части, чтобы извлечь костный воск пробки в чашку Петри для хранения.
2. Поместите кусок костного воска в положении 12 часов каждого хорошо и осторожно нажмите вниз с стерильной перчаткой указательный палец.
3. Pipette 50 мкл клеточной суспензии, содержащей 1 х^{10 5 раковых} клеток молочной железы в DMEM-10% FBS и Pen-Strep в центре каждого колодец 6-хорошо пластины. (В качестве альтернативы, семенные клетки в рассеянном шаблоне при желании.) Поместите пластину в инкубатор культуры тканей 37 градусов по Цельсию в течение 45 минут для содействия клеточной привязанности.
4. Поместите 1 фрагмент кости на 1 кусок костного воска для каждой экспериментальной хорошо и применить нежное давление с rongeur, чтобы обеспечить его. Выполните эксперименты в тройном так, что 3 фрагмента костей из данного образца THR помещаются в три верхние колодцы, в то время как три нижних колодца содержат костный воск только в качестве элементов управления.
5. Используя 5 мл пипетки, осторожно и медленно доставить 5 мл DMEM-10% FBS в сторону каждого хорошо, чтобы избежать вытеснения клеток молочной железы или фрагментов костей. Поместите тарелку в инкубатор культуры тканей 37 градусов по Цельсию на 20-24 часа.
6. Для выполнения биолюминесценции изображения (BLI) удалить пластину из инкубатора и добавить люциферин субстрат (для достижения концентрации 300 мкг / мл) к каждой хорошо. Изображение пластины сразу на платформе IVIS Imaging, используя следующие параметры: f-стоп 1, небольшое биннинг, время экспозиции 1 сек, уровень D. Измерьте интенсивность сигнала каждого из них, а также среднее сияние (фотоны/второй/квадратный сантиметр/стерадий).
7. Используйте программное обеспечение для визуализации для определения регионов интереса (ROI) для количественной оценки среднего сияния для всех экспериментальных и контрольных скважин. Экспорт средних значений сияния в лист Excel для выполнения статистики и генерации графиков.