ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन: ऊतक विशिष्ट कैंसर कोशिकाओं को वयस्क माउस में प्रत्यारोपित करना

1. कोशिकाओं की तैयारी (10 चूहों के लिए)

नोट: कोशिकाओं को कम सेल व्यवहार्यता से बचने के लिए पकवान से अलग होने के बाद 1 घंटे के भीतर टीका लगाया जाना चाहिए। विशेष रूप से, कोशिका निलंबन को उनकी व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए पकवान से कोशिकाओं को अलग करने के बाद 15 मिनट के भीतर जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण में मिलाया जाना चाहिए।

1. संस्कृति 4T1-luc2 कोशिकाओं, एक माउस स्तन adenocarcinoma सेल लाइन लूसिफ़ेरेस व्यक्त, RPMI १६४० मीडिया में 10% FBS के साथ एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 5% सीओ₂में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
2. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ 10-सेमी डिश में अनुयायी 4T1-luc2 कोशिकाओं को धोएं। P1000 पिपेट का उपयोग करके 0.25% ट्राइपसिन का 1 मिलियन एमएलए जोड़ें और फिर, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना को इनक्यूबेट करें। फिर, 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके 4 एमएल ग्रोथ मीडिया (आरपीएमआई-1640 10% एफबीएस के साथ) जोड़ें और ऊतक संस्कृति हुड में सेल निलंबन को 15-एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 180 x ग्राम पर सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें।
3. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें; फिर, हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
4. ऊतक संस्कृति हुड में ठंडे पीबीएस (पीएच 7.4, 4 डिग्री सेल्सियस) के 40 माइक्रोन में 2 x 10⁶ 4T1-luc2 कोशिकाओं को निलंबित करें।
5. ऊतक संस्कृति हुड में बर्फ पर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण के 360 माइक्रोन के साथ 40-माइक्रोल सेल सस्पेंशन मिलाएं।
   नोट: अंतिम एकाग्रता 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS: जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण) है। ऑर्थोटोपिक मॉडल (कोई मस्तूल नहीं) के लिए, दो सप्ताह के भीतर इच्छामृत्यु मानदंड (ट्यूमर आकार और 2 सेमी) तक पहुंचने से बचने के लिए अंतिम एकाग्रता के 1 x 10⁴/20 माइक्रोन का उपयोग किया गया था।

2. कैंसर सेल टीका

1. चूहों को 2-4% आइसोफ्लुनाणे और 0.2 एल/मिन ऑक्सीजन प्रवाह के साथ संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में रखें जब तक कि चूहे शांति से सांस लेते हैं (2-3 मिनट)।
2. माउस को पकड़ें और अपने कंधे में 0.05 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन इंजेक्ट करें।
3. एक अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी से पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करें । माउस मास्क के छेद में माउस की नाक डालें, जो एक चारकोल कनस्तर इकाई से जुड़े 2-4% आइसोफ्लाणे और 2 एल/मिन ऑक्सीजन प्रवाह के साथ साँस लेने वाला संज्ञाहरण की अनुमति देता है।
4. प्रयोगशाला टेप का उपयोग कर माउस के अंगों को नियंत्रित करें और कपास झाड़ू का उपयोग करके क्लोरहेक्सीडीन, आयोडीन और 75% इथेनॉल का उपयोग करके अपनी त्वचा को निष्फल करें।
5. बाँझ माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग कर पूर्वकाल छाती की दीवार के बीच में एक 5 मिमी त्वचा चीरा बनाओ, चीरा के बगल में दाईं ओर त्वचा लिफ्ट और छाती की दीवार से कैंची का उपयोग कर त्वचा अलग, और फिर, त्वचा उलटा करने के लिए सही #2 स्तन वसा पैड का पर्दाफाश ।
6. ध्यान से घाव के माध्यम से प्रत्यक्ष दृष्टि के तहत वसा पैड में एक 28.5 जी सुई के साथ एक 1 मिलीएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर कैंसर सेल निलंबन के 20 μL इंजेक्ट।
   नोट: सुई घाव से गुजरती है, त्वचा से नहीं। सुई को बाहर निकालने से पहले 5 एस के लिए वसा पैड में पकड़ रखें, जो जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण को जमना करने के लिए समय की अनुमति देता है।
7. बाँझ 5-0 गैर-अवशोषित टांके का उपयोग करके, सिलाई करके त्वचा के चीरों को बंद करें।
8. सर्जरी के बाद, जानवरों को एक साफ पिंजरे में वापस करें और उन्हें तब तक निगरानी करें जब तक कि वे बरामद न हो जाएं और स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ रहे हों (~ 1-2 मिनट के बाद)। यदि कोई जानवर सर्जरी के 24 घंटे के भीतर अच्छे स्वास्थ्य में दिखाई नहीं देता है, तो बुप्रेनोरफिन (0.2 मिलीग्राम/किलो) का प्रशासन करें।
9. संज्ञाहरण के तहत टांके निकालें (चरण 2.1 देखें) सर्जरी के बाद 7 डी।