Voorbereiding van de muis hersenweefsel voor Immunoelectron Microscopie
Summary
We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.
Abstract
Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) is uiterst nuttig voor het visualiseren van microglia, oligodendrocytic, astrocytaire, en neuronale subcellulaire compartimenten (dendriet, dendritische wervelkolom, axon, axon terminal, perikaryon), evenals hun intracellulaire organellen en cytoskelet, in het centrale zenuwstelsel bij hoge ruimtelijke resolutie. In combinatie met TEM, pre-embedding immunocytochemie kan de discriminatie van cellulaire elementen met weinig onderscheidende kenmerken en identificatie criteria (bv. microgliale perikarya en processen, bij het gebruik van een antilichaam tegen de microglia-specifieke marker Iba1 (geïoniseerd calcium binding adapter molecuul 1; zoals gepresenteerd hier)), het identificeren van de neurotransmitter inhoud van cellulaire elementen (bijvoorbeeld serotonine) en hun ultrastructurele lokalisatie van oplosbare of membraan-gebonden eiwitten (bijv. 5 HT1A en EphA4 receptoren). We beschrijven hier een protocol voor transcardiac perfusie van muizen met acroleïne fixatief, verwijdering en snijden van de hersenen, evenals immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) kleuring, hars inbedding, en de ultradunne snijden van de hersenen secties. Na voltooiing van deze procedures, de immunostained materiaal klaar is voor onderzoek met TEM. Bij het rigoureus uitgevoerd, deze techniek biedt een uitstekend compromis tussen optimale ultrastructurele behoud en immunocytochemische detectie.
Protocol
Discussion
Hier hebben we beschreven een protocol voor de voorbereiding van de hersenen van muizen weefsel voor immunoelectron microscopie, dat een uitstekend compromis tussen optimale ultrastructurele behoud en immunocytochemische detectie, wanneer de procedures zorgvuldig worden uitgevoerd biedt.
In combinatie met TEM, deze methode maakt het mogelijk om onderscheid te maken cellulaire elementen met weinig onderscheidende kenmerken en identificatie criteria. Met name de immunoperoxidase-DAB kleuring v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Shao-Ming Lu en Harris A. Gelbard voor het gebruik van een peristaltische pomp en vibratome, evenals Karen L. Bentley en Gayle Schneider op de Electron Microscope Onderzoek Core Facility van de Universiteit van Rochester Medical Center voor technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van het NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Burroughs Wellcome Fund, en de Alfred P. Sloan Foundation om AKM. M.-È.T. wordt gefinancierd door een Fonds de la recherche en sante du Quebec (FRSQ) post-doctorale opleiding award.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
