Une étape métabolomique: glucides, acides organiques et aminés quantifiés dans une procédure unique
Summary
La méthode d'uréase préparation des échantillons pour analyse GC / MS des métabolites intermédiaires est présenté par son inventeur. La méthode permet en une seule étape de suivi du dépistage néonatal des erreurs innées par spectrométrie de masse en tandem par les glucides quantifier, organiques et d'acides aminés tout dans un seul processus.
Abstract
Chaque enfant né aux États-Unis est maintenant projeté pour un maximum de 42 troubles génétiques rares appelées «erreurs innées du métabolisme". La méthode de dépistage est basé sur la spectrométrie de masse en tandem et quantifie acylcarnitines comme un écran pour des acides organiques et des mesures aussi des acides aminés. Tous les états également effectuer des tests enzymatiques pour les troubles des glucides tels que galactosémie. Parce que les résultats peuvent être non spécifiques, des tests de suivi des résultats positifs est nécessaire en utilisant une méthode plus définitive. Le présent rapport décrit les «uréase" méthode de préparation des échantillons pour le dépistage erreur innée. Uréase cristalline est utilisé pour éliminer l'urée à partir des fluides corporels, qui permet la plupart des autres métabolites hydrosolubles pour être déshydratés et transformés en dérivés pour la chromatographie en phase gazeuse dans une procédure unique. La déshydratation par évaporation dans un courant d'azote est facilitée par l'ajout d'acétonitrile et le chlorure de méthylène. Puis, triméthylsilylation a lieu dans la présence d'un catalyseur unique trifluoroacétate triéthylammonium,. D'injection automatisée et est suivie par chromatographie macro-conduit la quantification personnalisées de 192 métabolites et semi-quantification de tous les principaux composants en utilisant des bibliothèques spécialisées des spectres de masse des TMS dérivés des composés biologiques. L'analyse peut être effectuée sur la plate-forme Chemstation largement utilisé en utilisant les macros et les bibliothèques disponibles auprès de l'auteur. Dans notre laboratoire, plus de 16.000 échantillons de patients ont été analysés en utilisant la méthode avec un rendement diagnostique d'environ 17% – soit 17% des résultats des échantillons révèlent conclusions qui doivent être traitées par le médecin traitant. Inclus dans ce sont plus de 180 confirmés erreurs innées, dont environ 38% n'auraient pas pu être diagnostiquée à l'aide des méthodes précédentes.
Protocol
Discussion
La méthode uréase (1) a été cité 62 fois dans la littérature médicale avec diverses modifications. Groupe de Matsumoto (2,3) a simplifié la procédure de criblage à haut débit néonatale et a rapporté les résultats de 16000 patients. Kuhara et d'autres (4-7) ont rapporté l'utilisation de la méthode dans plusieurs cas de diagnostic d'erreur innée et de suivi. Rhead (8) a également confirmé l'utilité de la méthode pour le diagnostic clinique et le suivi des erreurs innées. La méthode a été appliquée à l'urine de l'ours, souris knock-out, des éléphants et des homogénats de mouches des fruits entiers et leurs larves (9). Les milieux de culture de Cryptococcus avant et après la mutagenèse dirigée ont également été analysés, sans l'étape uréase (10). La méthode a été appliquée à l'évaluation nutritionnelle des étudiants en médecine humaine, Bas patients présentant un syndrome démentiel et des anciens combattants âgés après le chargement des sujets avec des doses orales des acides aminés tryptophane, la méthionine et l'isoleucine (11). Tous les huit vitamines B ont été évaluées par la quantification des produits de dégradation des trois acides aminés qui, parmi eux, exigent que tous les 8 vitamines à un moment de leur dégradation. Les effets toxiques des produits pharmaceutiques et leur atténuation par la supplémentation en vitamine A a été signalé (12). Échantillons de liquide amniotique de grossesses normales du syndrome de Down et ont été analysées et rapportées (13-15).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'assistance technique de mesure Anthony Thomas est grandement appréciée.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MSD 5975 | Agilent | GC/MS/Computer | ||
| MSD 5973 | Agilent | GC/MS/Computer | ||
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 | |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes, Isotec, Cambridge Isotope Lab | |||
| Solvents | Fisher | |||
| Analytes | Sigma, Universidad Autonoma de Madrid, Ernesto Brunet | |||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | ||
| TEA/TFA | Fluka/Sigma | 09747 | ||
| Vials | Supelco/Sigma | Z115088/12EA | ||
| Merlin Microseal | Agilent | 5181-8815 | ||
| MSTFA | Thermal Scientific | 48913 |
References
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
