1) Vorbereiten Agarplatten Übersicht: Dieses Protokoll beschäftigt Agarplatten für zwei verschiedene Anwendungen. Erstens dienen die Agarplatten als Eiersammlung Oberfläche; Apfelsaft in der Agar stimuliert die Eiablage. Zweitens sind Embryonen im Agar eingebettet in eine feste Orientierung statt, wenn die Platten zentrifugiert werden; eine ausreichend hohe Konzentration von Agar ist notwendig, um die Platten vor der Auflösung während der Zentrifugation zu vermeiden. Der Einfachheit halber ist eine einzige Art von Apfelsaft-Agar für beide Zwecke eingesetzt werden. Materialien Agar (25 g) Saccharose (25 g) Apfelsaft (250 ml) Nipagin M Stammlösung (5 g Methyl-p-Hydroxy-benzoat in 50 ml Ethanol), wirkt als Konservierungsmittel Petrischalen: für die Zentrifugation (60x15mm) und für Ei-Sammlung (60×15 mm oder 100×15 mm, abhängig von der Fliege Käfige in Schritt 2 verwendet) Ausstattung Herdplatte Zwei Erlenmeyerkolben In einem Erlenmeyerkolben kombinieren 25 g Agar und 750 ml dH 2 O. Autoklaven für 50 min auf liquide Zyklus. In der Zwischenzeit bereiten Apfelsaft-Lösung (Schritt 1,2). In einem weiteren Erlenmeyerkolben kombinieren 25 g Saccharose und 250 ml Apfelsaft. Hitze auf heißer Platte (auf etwa 55 ° C) zu Saccharose aufzulösen. Dann fügen Sie 15 ml Nipagin M Lösung. Vermeiden Sie höhere Temperaturen, wie sie verursacht Nipagin zu brechen. Sobald der Agar-Lösung abgekühlt ist genug, dass die Flasche von Hand gehandhabt werden können, kombinieren die beiden Lösungen und gründlich mischen. Stir auf einer Heizplatte, bis es gleichmäßig gemischt. Lösung in den leeren Petrischalen (~ 0,5 cm hoch). 1 Liter Lösung reicht für etwa 100 kleine (60 mm Durchmesser) oder 40 große (100 mm Durchmesser) Gerichte. Agar-Platten sollten für mehrere Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur trocknen, sonst werden sie zu nass für den Einsatz. Für die langfristige Lagerung, halten sie verpackt (in Kunststoff-Behälter oder eine Petrischale Ärmel) bei 4 ° C. 2) Die Ernte Embryonen Übersicht: Während der ersten 3 Stunden nach der Entwicklung (bei Raumtemperatur), sind Drosophila Embryonen einzelne Zellen (nicht mitgerechnet die Keimbahn-Vorstufen, die hinten gelegen Pol-Zellen). Wenn richtig ausgerichtet Embryonen dieser Stadien zentrifugiert werden, die wichtigsten Organellen getrennt durch die Dichte entlang der Längsachse des Eies. Am Zellularisierung Bühne, ist diese große Zelle in Tausende von kleinen Zellen umgewandelt, die mit Zentrifugalkräften beschäftigt nicht brechen diese Zellen. Für eine erfolgreiche Trennung von wichtigen Organellen, ist es daher von entscheidender Bedeutung, um Embryonen, die noch nicht abgeschlossen Zellularisierung Zentrifuge. Materialien Apfelsaft-Agar-Platten Hefe-Paste (Trockenhefe mit Wasser zu Erdnuss-Butter Konsistenz gemischt) Ausstattung Fly Käfige: im Handel erhältlich (siehe unten) oder zu Hause entwickelter 1 Adult Fliegen sind in Käfigen, auf die Apfelsaft-Agar-Platten an der Unterseite angebracht gehalten werden. Verwenden einer Größe von Petrischalen geeignet für die Käfige im Einsatz. Zur Einleitung ein Ei Sammlung, bereiten Sie einen frischen Apfelsaft-Agar-Platte und decken einen Teil mit Hefe einzufügen. Fruchtfliegen essen Hefe, insbesondere bietet Hefeernährung für die Eiererzeugung. Die Anwesenheit von Hefe-und Apfelsaft im Agar induziert auch die Eiablage. Zum Austausch der alten mit der neuen Agarplatte, ist die Fliege Käfig invertiert und schlug auf der Tischplatte ein paar mal. Die Fliegen werden auf den Boden sinken und werden kurz desorientiert. Das gibt Ihnen ein paar Sekunden, um schnell entfernen Sie eine Agar-Platte und ersetzen Sie ihn durch einen neuen. Dieser Austausch erfordert einige Übung und Details hängen von der Art des Käfigs beschäftigt. Weibliche Fliegen speichern Spermien aus früheren Verpaarungen in internen Beutel (spermathecae), aus denen Spermien freigesetzt Befruchtung von Eiern zu ermöglichen. Als gut gefüttert und ungestört, legen die Weibchen Eier kurz nach der Befruchtung und damit die Zeit der Eiablage markiert den Zeitpunkt der Befruchtung und der Anfang der Entwicklung. Wenn die Bedingungen nicht optimal sind, halten Weibchen befruchtete Eier für variable Zeiten vor der Verlegung. Zur Minimierung der Anzahl solcher falsch inszeniert Embryonen, ist es ratsam, die erste Kollektion des Arbeitstages ("Pre-Kollektion" von 30 bis 60 min ist ausreichend) zu verwerfen. Die Anwesenheit der frische Hefe induziert die Weibchen, um diese statt Eier zu legen, und die anschließende Ei Sammlungen neigen dazu, durch Eier dominiert hinterlegt kurz nach der Befruchtung. Sammle Eier für bis zu 3 Stunden, je nachdem, welche Embryonalstadium gewünscht ist. Da bei Raumtemperatur Zellularisierung nach ~ 3,5 Stunden abgeschlossen ist, werden mehr Abholzeiten nicht sinnvoll. Die meisten konsequente Schichtung ist bei jungen Embryonen erreicht, so dass für Routine-Experimente, die wir für kürzere Abholzeiten (1 hroder weniger). Manchmal fliegt zu bekommen, um die Hefe oder an der Oberfläche der Agarplatte stecken. Entfernen Sie sie mit einer Pinzette. 3) Entfernen der Eierschale aus den Embryonen Übersicht: einer äußeren Schicht (Chorion) von Protein und einer inneren Schicht aus (Dotterhaut) überwiegend aus Wachs: Drosophila Embryonen werden durch zwei Schutzschichten abgedeckt. Sie schützen den Embryo vor mechanischen Beleidigungen und Austrocknung. Das Chorion hat zwei Erweiterungen (das Ei Fäden oder Rückenanhänge), die gut sichtbar im Unterschied Strukturen sind. In diesem Schritt werden wir das Chorion durch Einweichen die Eier in 50% Bleichmittel entfernen. Sobald das Chorion entfernt wird, wird der Embryo im Durchlicht transparent, so dass die Auswahl spezifischer Embryonalstadien für die Zentrifugation. Wie das Chorion würde auch mit vielen post-Zentrifugation Verfahren (zB Fixierung in Schritt 6) eingreifen, die Entfernung des Chorion nun schnelle Bearbeitung später ermöglichen. Die 50% Bleichmittel behandelt wird das Chorion in wenigen Minuten zu lösen, aber es schadet nicht der Embryo. Die Dotterhaut hält die ausbleichen. Wir werden weiterhin das Bleichmittel behandelt, bis das Ei Filamente nicht mehr sichtbar sind. Danach werden wir die Embryonen aus der Bleiche getrennt, indem man das Embryo / Bleiche Aufschlämmung durch ein winziges Sieb (ein Korb aus Drahtgitter). Es ist entscheidend, nicht das Bleichmittel Exposition Schritt überstürzen. Wenn das Bleichmittel wird vorzeitig, späteren Schritten gewaschen (zB Entfernung der Dotterhaut folgenden Fixierung) gefährdet sein könnte. Materialien: Squirt Flasche mit 50% Bleichmittel (ein Volumen dH 2 O zu einem Volumen handelsübliche Bleiche) Spritzflasche mit dH 2 O Papierhandtuchspender Ausstattung: Hausgemachte Drahtkörbe gestellt von Blatt Edelstahl-Drahtgeflecht. Um Körbe, geschnitten Quadrate ~ 2 x 2 cm aus dem flachen Bogen und Gedankenstrich sie in der Mitte. Pinzette zu halten Drahtkörbe Präpariermikroskop für Durchleuchtung eingestellt Legen Sie die Agar-Platte unter einem Binokular und beobachten Sie die Embryonen durch Durchleuchtung. Vergewissern Sie sich, um das Ei Filamente zu identifizieren (siehe Abbildung 2A). Squirt 50% Bleichmittel auf die Agar-Platte, für die Embryonen. Man schüttelt die Agarplatte gelegentlich zu wirbeln die Embryonen etwa in der Bleiche. Sobald das Ei Filamente nicht mehr (in der Regel nach 3-5 min, aber die Zeiten können variieren) sichtbar ist, hat das Chorion wurde erfolgreich entfernt. Im nächsten Schritt wird ein Drahtgeflecht Warenkorb als Sieb verwendet werden, um die Embryonen aus der Bleiche zu trennen. Besorgen Sie sich die Drahtkorb mit einer Pinzette und halten ihn über den invertierten Abdeckung der Agarplatte. Der Deckel wird als Reservoir dienen dazu, die Bleiche tropft durch das Drahtgeflecht zu fangen. Gießen Sie die Bleiche / Embryo Schlamm aus der Agarplatte durch das Drahtgeflecht. Wenn eine signifikante Anzahl von Embryonen bleiben auf der Agarplatte, spritzen dH 2 O auf den Teller und gießen Sie die dH 2 O / Embryo Schlamm durch das Drahtgeflecht. Wenn eine signifikante Anzahl von Embryonen übergreifen in das Reservoir, gießen Sie den Inhalt Reservoir durch das Drahtgeflecht. Berühren Sie die Unterseite des Drahtgeflecht zu einem Papiertuch zu tilgen entfernt überschüssige Flüssigkeit. Dann spritzen dH 2 O auf das Drahtgeflecht abzuspülen verbleibenden Bleichmittel. Wie oben beschrieben, kann die Abdeckplatte als Reservoir verwendet werden, um alle Embryonen versehentlich abgewaschen erholen. Sie können zu minimieren verlieren Embryonen, indem der Strom von Wasser aus der Spritzflasche entlang des Umfangs der Drahtkorb. Häufig abtupfen überschüssige Flüssigkeit. Wiederholen Sie diesen Waschschritt fünf vor zehn Mal, bis alle Bleiche entfernt worden ist. Wenn der Drahtkorb riecht noch nach Bleichmittel, sollte Waschen fortzusetzen. 4) Montage Embryonen in Agar Übersicht: Drosophila Eier sind viel länger (~ 500 pm) als breit (~ 180 um). Um maximale und die konsequente Trennung von Organellen während der Zentrifugation zu erhalten, orientieren wir Embryonen, so dass ihre vorderen Enden weisen auf den Drehpunkt (Abb. 1, 3). Auf diese Weise reichern sich die leichteste intrazellulären Strukturen (Fetttröpfchen) am vorderen Ende in alle Embryonen, während sehr dichte Strukturen (Dotter-Komponenten) in der Nähe des hinteren Endes zu akkumulieren. Die Embryonen werden in kleine senkrechte Löcher in Apfelsaft-Agar eingesetzt, wobei die vorderen Enden ragten. Der Agar hält den Embryo in eine feste Orientierung während der Zentrifugation. Ausstattung: Nadelhalter Tungsten Nadeln, die Nadeln werden in die Halterung nach hinten von der typischen Ausrichtung montiert, so dass das stumpfe Ende aus Stöcken und ist verfügbar, um die Embryonen zu manipulieren P200 Pipette Präpariermikroskop für transilluminatio gesetztn Fly Bürste (kleine Pinsel zur Behandlung von erwachsenen Drosophila Art) Materialien: Triton Salt Solution (TSS): 4g NaCl, 0,3 ml Triton X-100, zu füllen mit ddH 2 O auf 1000 ml (kann als 10x-Stammlösung hergestellt werden) Wash Embryonen aus dem Drahtkorb mit TSS und in eine leere Petrischale. Die Embryonen sollten auf den Boden sinken. Übertragen Sie die Petrischale mit den Embryonen in TSS auf ein Binokular und beobachten durch Durchleuchtung (Embryonen wird ähnlich aussehen wie in Abbildung 4 dargestellt). Mit einer Pipette P200, wählen Embryonen der gewünschten Stufen und sie auf eine kleine Agarplatte. Spezifische Stufen können leicht visuell erkannt werden (Abbildung 4; für weitere Details, siehe 1). Arbeiten Sie schnell, da Embryonen Alterung und längerem Eintauchen (länger als 30 min) in TSS kann die Entwicklung beeinflussen. Entfernen Sie die meisten TSS mit einer Pipette und eine Kimwipe. Die Oberfläche des Agar sollte leicht feucht, das macht es einfacher, Embryonen herumschubsen. Allerdings sollte es nicht Pools verbliebene Flüssigkeit irgendwo auf der Platte, da überschüssige Flüssigkeit während der Zentrifugation bewirkt, dass die Embryonen zu rutschen aus den Löchern werden. Mit einer Nadel, poke vertikale Löcher in den Agar in der Nähe, wo ein Embryo befindet. Es ist schwer, Löcher, die perfekt senkrecht stehen Sack, weil man die Nadel in einem Winkel halten zu können, gleichzeitig unter dem Mikroskop zu sehen sind. Eine geringfügige Neigung der Nadel ist sogar von Vorteil, weil dies schafft eine leichte Depression / Hain auf der einen Seite des Loches so dass der Embryo wird einfach entlang und in das Loch gleiten. Es ist ausreichend, um die Punktion der Oberfläche des Agar-Agar, da die weich genug ist, dass einmal ein Embryo teilweise in ein Loch in weiter ohne Schaden geschoben werden können eingefügt. Vergewissern Sie sich, erkennen Sie die vorderen und hinteren Ende des Embryos, da die Embryonen in die Löcher in der konsequenten Ausrichtung geschoben werden sollte, in der Regel mit dem vorderen Ende. Die Dotterhaut am vorderen Ende wird durch eine spezielle Struktur gekennzeichnet, die Mikropyle (Abbildung 2), durch die die Spermien bei der Befruchtung tritt. Mit dem stumpfen Ende der Nadel, können Sie gegen den Embryo drücken, um es an den Agar zu bewegen und zu orientieren / Manöver ihrem hinteren Ende in Richtung einer punktierten Loch. Dann gegen das vordere Ende Vorstoß in Richtung der Bohrung. Dies sollte leicht gleiten die Embryos in das Loch entlang der leichten Depression beim Durchstechen generiert. Da der Embryo kippt nach oben, schieben Sie sie tiefer in das Loch. Wenn es vollständig eingedrückt wird der Embryo in der Regel schon ziemlich senkrecht. Wenn nicht, können Sie das eingefügte Embryo mehr vertikal ausrichten, indem Sie auf sie seitlich. Wenn das Loch nicht zu groß ist, wird der Embryo Position stabil durch das Agar in Zentrifugation statt. Mit etwas Übung ist es möglich, 100-250 Embryonen pro Platte einbinden. Es wird von der jeweiligen Anwendung, wie viele benötigt werden abhängig: Wenn Embryonen für Live-Aufnahmen oder als Spender für die Transplantation Versuche verwendet werden, nur wenige sind erforderlich. Wenn Embryonen zu Festnetz-und immungefärbt werden sollen, wird ein Bruchteil in der Post-Zentrifugation Verarbeitung verloren, und man muss mit höheren Zahlen zu beginnen. Beachten Sie, dass Embryonen während der Montage so, wenn eine enge Entwicklungsphase gewünscht ist, die gesamte Zeit bei der Montage muss immer zu kurz sein weiterentwickeln. Wenn es irgendwelche Embryonen übrig, die nicht eingebettet wurden, entfernen Sie sie von der Platte mit einem feuchten Pinsel zu fliegen. Dip-the-fly Pinsel in Flüssigkeit (zB 1xTSS), sorgfältig über die Oberseite der Platte wischen (beim Betrachten unter dem Binokular) zu fegen alle übrig gebliebenen Embryonen, und waschen Sie die Embryonen aus der Bürste durch Eintauchen des Pinsels in die Flüssigkeit wieder. 5) Die Zentrifugation und Gewinnung von Embryonen Übersicht: Die Platten sind zum Schwingen Eimern einer Sorvall RT7 Plus Zentrifuge überführt und zentrifugiert für 30 min bei 4000 rpm, die ~ 3000 g. entspricht Nach der Zentrifugation werden die Platten mit TSS abgedeckt. Mit einer Nadel werden Embryonen aus den Löchern in den Agar gegraben und verlegt in geeignete Gefäße über eine Pipette. Ausstattung: Nadelhalter mit Nadel (wie bisher) Sorvall RT7 Plus mit RTH750 Rotor und schwingenden Eimer, oder gleich 2 Präpariermikroskop für Durchleuchtung eingestellt P200 Pipette Materialien: TSS Transfer-Platten zu schwingen Eimer der Zentrifuge, Agar nach unten. Stellen Sie sicher, Zentrifuge gleichmäßig ausgewogen ist. Einstellungen für die Zentrifugation: Temperatur = 4-10 ° C, Drehzahl n = 4000, = 30 min. Nach der Zentrifugation Ort Agarplatte unter dem Binokular wieder und die Platte abgedeckt mit einer Schicht von TSS. Mit dem bLunt Ende der Nadel, graben die Embryonen aus ihren Löchern. Sie werden in TSS float, sondern bleiben unter Wasser. Embryonen erscheint offensichtlich geschichtet, mit einer braunen Kappe am vorderen Ende eine klare mittleren Bereich, und eine dunkle, graue Fläche am hinteren Ende (Abbildung 2, 5A). Discard Embryonen, die zu deutlichen Schichtung zeigen, scheitern. Mit einer Pipette P200, übertragen Sie die gut geschichteten Embryonen in TSS in ein neues Gefäß, zB ein Szintillationsfläschchen oder Mikrozentrifugenröhrchen, je nach Anwendung. 6) Die weitere Verarbeitung Je nach Anwendung werden Embryonen anschließend auf verschiedene Weise behandelt werden. Für die direkte Beobachtung von Hellfeld-oder Epifluoreszenzmikroskopie sind Embryonen im Puffer auf einen Objektträger übertragen und montiert unter einem 22×22 mm # 1.5 Deckglas, mit 18×18 mm Nr. 1 Deckgläser als Abstandshalter. Für Langzeitbeobachtungen, kann es notwendig sein, um den Puffer mit Halocarbonöl 27 zu ersetzen. Wenn Embryonen zu befestigen sind, sollten sie in Schritt 5,6 bis ein Szintillationsfläschchen übertragen werden. Sie können dann fixiert unter Verwendung von Standard Fixationstechniken 1 sein. Diese Techniken typischerweise Rühren in einer Heptan-Methanol-Emulsion, die Dotterhaut zu entfernen. Beachten Sie, dass für zentrifugiert Embryonen die Effizienz dieser devitellinization Schritt niedrig ist. Es ist daher ratsam, mit so vielen Embryonen als praktische starten oder die Dotterhaut manuell 1 zu entfernen. Wenn Embryonen in der Transplantationsmedizin Experimente (z. B. zu einem bestimmten Organellen Schicht von der zentrifugiert Embryonen zu entfernen) verwendet werden, sind sie auf Agarplatten übertragen und montiert auf Deckgläsern, unter Verwendung von Standardverfahren für unzentrifugierten Embryonen 3. Die Schichtung durch Zentrifugation induziert wird für zehn Minuten stabil. 7) Repräsentative Ergebnisse Wenn die Zentrifugation wie erwartet funktioniert, wird die große embryonalen Organellen Art von Dichte 2. Zum Beispiel wird der Low-Density-Lipidtröpfchen am vorderen Ende ansammeln, die mit hoher Dichte Eigelb Vesikel wird am hinteren Ende (Abbildung 1, 2) zu akkumulieren. Fetttröpfchen und Eigelb Vesikel Lagerung Organellen für Lipide und Proteine. Bestätigung der Dichte-abhängige Schichtung erfolgt über visuelle Inspektion der lebenden Embryonen durch Durchleuchtung unter einem sezieren oder zusammengesetzte Mikroskop erreicht. Die Embryonen, wie in Abbildung 5A erscheinen: Die Lipid-Tröpfchen wird eine solide braune Schicht an der sehr vorderen Spitze (eine "Lipid-cap") bilden; Eigelb Akkumulation in einer dunkelgrauen Zone am hinteren Ende führen. Diese beiden dunklen Schichten sind durch eine breite klare Zone, die anderen Organellen und Cytoplasma stellt getrennt. Wenn Embryonen nach Zellularisierung werden zentrifugiert, wird Schichtung minimal sein (Abbildung 5C). Wenn ein Epifluoreszenzmikroskop verfügbar ist, können diese lebenden, zentrifugiert Embryonen unter UV-Anregung untersucht werden. Unter diesen Bedingungen zeigt das Eigelb intensive blaue Autofluoreszenz (Abbildung 5B). Eine kompakte Schicht aus autofluoreszierenden Material am hinteren Pol zeigt die erfolgreiche Zentrifugation und dient als Marker für das hintere Ende. Beachten Sie, dass das Erscheinungsbild dieser Schichten drastisch ändern, wenn die Embryonen fixiert sind. Zum Beispiel, wenn Embryonen, die durch Standard-Wärme-oder Formaldehyd Fixierung sind fest von Heptan-Methanol devitellinization 1 gefolgt, werden die Fetttröpfchen durchscheinend und die Lipidschicht erscheint weißlich und flauschige durch helles Licht-Mikroskopie, anstatt dunkelbraun (Abb. 5D). Yolk Autofluoreszenz ist teilweise oder vollständig durch Fixierung zerstört, immer viel weniger intensiv oder gar nicht nachweisbar. Wenn in-vivo Zentrifugation wird eingesetzt, um eine bestimmte Organellen zu markieren, ist es hilfreich, Label, das Organellen mit einem fluoreszierenden Marker für die Bestätigung. Zum Beispiel, YFP-Fusionsproteine gezielt an die Mitochondrien, die ER oder Golgi worden 4 beschrieben. In zentrifugiert Embryonen, reichern sich diese Marker an charakteristischen Stellen entlang der vorderen hinteren Achse (Abbildung 1). Schließlich lokalisieren bestimmten Histon-Fusionsproteine sowohl Fetttröpfchen und Kerne 2, und damit lassen sich diese zellulären Kompartimenten (Abbildung 5 E, F) sowie Mark auf die Bühne des Embryos überwacht werden (durch die Anzahl der markierten Kerne) . Fly-Stämme, die Markierungen in diesem Absatz genannten sind von der Bloomington Drosophila Stock Center (http://flystocks.bio.indiana.edu/) zur Verfügung. Für Histon H2Av sind beide GFP und mRFP Varianten 5, 6 Abbildung 1. Trennung von Organellen durch Zentrifugation (modifiziert nach 2). Zentrifugation von orientierten Embryonen Ergebnisse in unterschiedlichen Schichtung(Tageslicht). Wichtige Organellen sammeln sich an charakteristischen Stellen entlang der anterior (up) – posterior (down)-Achse: Fetttröpfchen (erkannt in festen Embryonen von Nile Red-Färbung); endoplasmatischen Retikulum, Golgi und Mitochondrien (erkannt in lebenden Embryonen über die YFP Marker beschrieben in Haupttext); Eigelb (nachgewiesen durch Autofluoreszenz). Die Fluoreszenz-Bilder wurden durch konfokale Mikroskopie erworben. Abbildung 2. Schematische Darstellung des Embryos. A. Ei mit Eierschale und den prominenten Ei Filamente (Rückenanhänge). Wie die Eierschale ist nicht transparent, erscheint das Ei gleichmäßig dunkel. B. Ei mit Chorion entfernt. Am vorderen Ende (links), ist die Mikropyle sichtbar. Je nach Entwicklungsstadium, wird der Embryo innerhalb der Dotterhaut erscheinen einheitlich dunkelbraun oder zeigen verschiedene Strukturen. Siehe Abbildung 4 für Beispiele. C zentrifugiert Embryo, orientiert wie im Protokoll beschrieben. Fetttröpfchen sammeln als braunes "cap" an der Mikropyle end; Eigelb bildet eine graue Schicht auf oder nahe dem entgegengesetzten Ende. Abbildung 3. Schematische Darstellung des Verfahrens. Links: Embryonen ohne Chorion sind oben auf einer Agarplatte gelegt und schob mit einer Nadel in die Löcher in den Agar. Diese Montage ergibt sich eine konsequente Ausrichtung aller Embryonen, mit vorderen landet. Rechts: Nach Zentrifugation werden Embryonen geschichtet. Agar ist mit TSS (blau) überlagert, und Embryonen sind von der Agar mit der Nadel wieder. Einmal in TSS ausgesetzt, können Embryonen mit einer Pipette aufgenommen werden. Abbildung 4. Bright-Licht Bilder von lebenden Drosophila-Embryos, ähnlich wie sie in Schritt 4.1 erscheinen. Die Embryonen werden in Standard-Orientierung dargestellt: vordere Ende auf der linken, hinteren Ende auf der rechten Seite, Rücken nach oben und Bauchseite nach unten. Ein Zeitraffer-Film der frühen Embryogenese ist als Teil des Videos zu dieser Protokoll. A. Spaltung Embryonen erscheinen gleichmäßig braun. Stages wie diese sind ideal für In-vivo-Zentrifugation. B. Blastoderm Embryonen haben eine klare Felge, die ähnlich wie auf allen Seiten angezeigt wird. Diese klare Peripherie ist in Teil aufgrund der Ansammlung von Kernen an der Plasmamembran und zum Teil aufgrund innerer Transport von Vesikeln und Eigelb Lipidtröpfchen 7. Diese klare Peripherie erweitert, bis am Ende der Zellularisierung 1. Embryonen können noch erfolgreich geschichtete durch Zentrifugation bis zum Ende des Zellularisierung 8, obwohl Schichtung von Eigelb und Kerne nicht so konsequent wie in Furchungsstadien. C. Nach Zellularisierung erscheinen Embryonen asymmetrischen; dorsalen und ventralen Seiten werden deutlich, und verschiedenen Falten entwickeln. Der Embryo gezeigt wird in der frühen Keim-Band-Erweiterung. In diesen Phasen ist die Zentrifugation nicht mehr an die Stratifizierung der wichtigsten Organellen wirksam. Abbildung 5. Zentrifugierte Embryonen. Alle Embryonen in dieser Zahl waren mit ihrem vorderen Ende nach oben und zentrifugiert werden in dieser Ausrichtung gezeigt. A. Bright-Licht Bild eines erfolgreichen zentrifugiert Embryo. Eine braune Schicht an der sehr vorderen Ende ist auf Lipid-Tröpfchen-Akkumulation. Eine breite, graue Schicht in der Nähe des hinteren Endes ist darauf zurückzuführen, Eigelb Vesikel. Es ist häufig eine klare Zone unterhalb der Dotter-Schicht, von unbekannter Herkunft. Eine gelbliche Zone ist oft höher als das Eigelb Schicht sichtbar, es stellt wahrscheinlich Mitochondrien. Lösliche Proteine sind in der klaren Schicht zwischen Fetttröpfchen und Eigelb 2 gefunden. B. Der Embryo in A durch Epifluoreszenzmikroskopie unter UV-Anregung angesehen. Die blaue Autofluoreszenz charakteristischen Dotter hilft bei der Identifizierung des hinteren Endes. C. Embryo zentrifugiert während Keim-Band-Erweiterung, dh nach Zellularisierung. Yolk möglicherweise noch am hinteren Ende ansammeln, aber ansonsten Schichtung ist minimal. D. Erfolgreich geschichtete Embryo nach Hitzefixierung. Die Lipid-Tröpfchen-Schicht erscheint weiß und flauschig, anstatt dunkelbraun wie in unfixierten Embryonen (A). E. & F. Embryonen zum Ausdruck His2Av-GFP und abgebildet durch konfokale Mikroskopie (modifiziert nach 2). E: bei Furchungsstadien zentrifugiert; His2Av-GFP scheint erst der Lipid-Tröpfchen-Schicht, da nur wenige Kerne zu dieser Zeit gebildet werden. Abhängig von der Fokusebene kann Kerne werden direkt unter dem Tropfen Ebene sichtbar (hier nicht abgebildet). F: Bei Blastoderm Phasen zentrifugiert; His2Av-GFP ist sowohl der Lipid-Tröpfchen-Schicht (oben) und Kerne (in einer breiten Zone unterhalb des Tropfens Schicht).