Подготовка Разработка и взрослых Drosophila Мозги и сетчатки для живых изображений

1. Введение В этом видеоролике мы покажем, как готовить дрозофилы мозга и сетчатки для живого изображения и иммуногистохимии с акцентом на фоторецепторных клеток. Во-первых, мы покажем, как подготовиться к мозгу вскрытия. Далее мы продемонстрируем два базовых вскрытия обычно используется для иммуногистохимии, которые формируют основу для живого препаратов. Эти два препарата взрослого мозга и глаз вскрытия. Далее мы продемонстрируем вскрытия использоваться для живых изображений взрослого и развивающегося мозга с акцентом на их использование для живого изображения фоторецепторов. Наконец, мы опишем, как мы образ живой ткани и покажем несколько примеров живого изображения с использованием резонансных конфокальной микроскопии. 2. Препарирование подготовки Для хорошего вскрытия, необходимо резкое щипцами. Использование заточки блок или очень тонкой наждачной бумагой (> 1500), мягко пройти щипцы взад и вперед с каждой стороны, пока концы с концами на тонкий момент. Мы используем стандартные точильный камень. Мы не будем рассматривать технику заточки здесь, но отмечают, что резкое щипцов имеют важное значение для живых вскрытия. Получены уточнения щипцы перед каждым рассечение. Для взрослых вскрытия головного мозга, место летает на CO 2 площадки для обезболить их и разобраться желаемого генотипа. Для вскрытия куколки, просто достичь во флакон и осторожно удалите куколки с пинцетом, осторожно, чтобы избежать нарушения куколки случае. Смочите Kimwipe с водой. Вы будете использовать это во время вскрытия для удаления мусора с вашего щипцами. Позиция рассекает блюдо на стадии стереоскоп и залейте его HL3 решение 1. Все вскрытия будут проводиться в HL3, чтобы ткань остается живым и здоровым во время вскрытия процедуры. Кроме того, мы используем рассечение блюдо, которое имеет дно покрытие Sylgard для защиты щипцов во время вскрытия. Теперь, подготовить фиксации решение, если вы планируете выполнять иммуногистохимии. Место 180μL из HL3 в 500 мкл трубки микроцентрифужных. Добавить 20 мкл 37% формальдегида для получения 3,7% раствора формальдегида. Наконец, правильное положение рук имеет важное значение для хорошего вскрытия. С хорошей позиции стороны, ваши щипцы будет устойчивой и способной контролировать, тонкие движения. Во-первых, место щипцов на стороне большого пальца. Затем довести указательным пальцем прямо вниз так, чтобы кончик пальца опирается на вершине. Теперь остальные стороне щипцов на стороне среднего пальца и перейти к рассечение блюдо. Сделать физический контакт с блюдом вашим большим и средним пальцами. Во время отдыха большим пальцем и средним пальцем на блюдо, завод запястье на столик микроскопа. Таким образом, у вас есть три очка посадили твердо на поверхности во время вскрытия, и сейчас можно сделать очень тонкие манипуляции щипцами. Эта техника может чувствовать себя немного неловко, на первый, но с практикой, вы скоро будете мастером мозг вскрытия. 3. Взрослый мозг На CO 2 площадки, ориентировать взрослых летать брюшной стороне с голову от вашей руки. Захватите грудной клетки чуть ниже головы. Если все сделано правильно, ноги и хобот будет расширяться. При просмотре под стереоскоп, захватить расширенные хоботок с щипцы для удаления головы. Откажитесь от тела и погрузите голову. Переориентация на погруженной головой. Весь вскрытие будет осуществляться по решению. Это очень важно, чтобы держаться на голову щипцами во все времена. В противном случае, голова будет плавать и его трудно получить. Если голова движется не в фокусе во время вскрытия, просто переместите его обратно в фокальной плоскости без корректировки микроскопом. Это, казалось бы простая задача может быть трудно поначалу, но, сохраняя голову в центре внимания будет легче с течением времени. Начало вскрытия сначала разрыв соединительной ткани между хоботком и глаз. Слеза через глаз, держа крепко, по крайней мере один щипцов во все времена. Будьте уверены, что палец щипцами только непосредственно под сетчаткой или кутикулу, чтобы избежать повреждения мозга под ним. Переменный влево и вправо, использовать щипцы, чтобы оторвать сетчатки, работая в направлении задней части головы. Отторжение сетчатки увеличит шансы того, что пластинка остается прикрепленной к оптической доле на протяжении всего этого рассечение. Продолжите вокруг задней части головы, разрыв кутикулы на этом пути. Слеза через другой глаз и начать отстраняясь кутикулы. Пока вам нужны кутикулы, вы знаете, вы не дробления мозга! Имея это в виду, продолжают тянуть кутикулы и сетчатки далеко, пока мозг раскрывается. Как только мозг является видимым, вы можете начать удалять трахеи прилагается к мозгу (рис. 1А). Продолжайте тянуть на трахею и кутикулы до мозга выделяют. На данный момент, вы должны переориентировать на нижней части блюдо для тОн оставшиеся шаги. Удалите оставшиеся трахеи, потому что ваш мозг в противном случае могут плавать во время ночных моет антител. Для визуализации фоторецепторов терминалы, желательно сохранить пластинки, но вам нужно удалить сетчатку, которая содержит клеточных тел и сильно autofluorescent пигмента. Чтобы сделать это, осторожно вытащите на густые и пигментных сотовой остается без повреждения пластинки. Это тонкие навыки и требует практики. Взрослый мозг может быть поддержана в течение нескольких часов или даже дней, используя условия, которые мы обсудим в разделе 6. Для иммуногистохимии, взрослый мозг теперь готов быть зафиксировано в формальдегид. 2 Используйте P20 pipetteman установлен в 5 мкл двигаться мозга взрослого человека в фиксирующем растворе вы уже подготовлены. Продолжить вскрытии мозга взрослого человека в течение 20 минут, которое должно дать 4-10 мозги. Оставьте мозги в исправление еще на 40 минут, однако этот срок может меняться для оптимального первичного окрашивания антител. Удалить раствор формальдегида и промыть мозги 3 раза по 5 минут каждый в 400μL раствора, содержащего PBS и 0,4% TritonX-100, далее PBS-Тритон. После полного вымывания исправить решение, вы можете добавить первичный раствор антител. 4. Взрослый глаз Начните этот рассечение, как описано для мозга взрослого человека. После погружения головы и переориентации микроскоп, начните с разрыва соединительной ткани между хоботком и глаз. Над хоботок, отдельные кутикулу от глаз. Теперь отдельные кутикулу от нижней части глаза, работая в направлении задней части головы. С одним пинцетом, захватить центре задней части головы. С другой, возьмите глаза и тянуть. Разрешить глаза на оседают на дно тарелки (рис. 1В). Пластинки, вероятно, все еще быть присоединен к глазу и может быть использован для живых изображений терминалы совершенно неповрежденные клетки фоторецепторов в это время. Чтобы продолжить жить изображений органов фоторецепторных клеток, перейдите к разделу 4.5. В следующих трех разделах объясняется фиксированной иммуногистохимии глаз. Для иммуногистохимии, перемещать глаза к фиксации решения с использованием P20 pipetteman установлен в 5 мкл. Продолжить вскрытии взрослого глаза в общей сложности 10 минут. Оставьте глаза исправить еще в течение 30 минут. Удалить решение исправить и провести моет, как это описано у взрослых рассечение мозга. Если вы хотите в конечном итоге изображение омматидия структуры глаза пластинка должна быть удалена сейчас. Вернуться фиксированной глаза на ваши рассекает блюдо и удалить все трахею или жировые клетки, которые могут все еще быть приложена. Затем, удерживая за пределами глаз с одним щипцы, удалить пластинки с другом. Она должна оторваться в один кусок, обнажив cellbodies снизу (рис. 1б). Будьте осторожны, чтобы захватить пластинки только! В противном случае, вы рискуете отсоединения от фоторецепторов сетчатки. Использование pipetteman P20, перемещать глаза на 400uL PBS-Тритон в 500uL трубки. Осторожно их на 4 градуса ночью, чтобы удалить autofluorescent красный пигмент от фоторецепторов. На следующий день, вы можете отказаться от промывочного раствора и добавить первичный раствор антител. Для живых изображений взрослых глазами мы используем только pharate мухи взрослых, т.е. более поздние стадии куколки незадолго до eclosion. На данном этапе, фоторецепторных клеток органов отдельно от терминалов в пластинку во время вскрытия. Pharate взрослых куколки имеют четко определенные крылья, глаза и кутикулы видны через куколки случае. Выберите куколки и снять переднюю часть куколки случае подвергать области головы. Осторожно снимите тонкую внутреннюю мембрану, которая дополнительно охватывает разработку летать. Захватите основанию головы с пинцетом и вытащить. Откажитесь от остальной куколки, держа голову под водой. Приступить как показано в глаза рассечение для иммуногистохимии. На этапе pharate взрослых, однако, органов фоторецепторных клеток будет отделить легче от пластинки, позволяя изображения клеточных тел расположен в сетчатке. Кроме того, пластинка остается прикрепленной к оптической доле, позволяя изображение дистальной пластинки. Если вы хотите, чтобы изображение проксимальной пластинки, где картриджи фоторецепторов терминала можно увидеть, а затем выполнить рассечение на глаз взрослого летать где пластинка более сильно привязаны к глазу. 5. Разработка глаз-мозг диск комплексов Развивающегося глаза диск на 20% куколки развития (P +20%) стал любимым для живого изображения в нашей лаборатории, потому что это один слой относительно крупных развивающихся клеток легко наблюдаемых с помощью конфокальной микроскопии. 3 Чтобы выбрать 20%, куколки, ищите мальпигиевых сосудов, зеленое пятно появляется под куколки случае, и во избежание куколки, которые имеют "темное тело" 4. После выбора P +20% куколки, погрузить его в HL3 в рассекает блюдо и осторожно снять переднюю часть куколки мешок, соблюдая осторожность,не проникать тонкой внутренней оболочкой. Возьмитесь за внутреннюю мембрану с пинцетом и растащить. Тщательно поиск по выпустили содержимое, чтобы найти развивающегося мозга и глаз, диски, которые являются весьма заметное (рис. 1в). Глаз-мозг диск комплекса легко отделяется на этой стадии метаморфоза. Изолировать мозга в нижней части рассекает блюдо. Аккуратно отделите центрального мозга от оптической доле. Оптические доли / глаз диск будет использоваться в живых изображений. 6. Живая Imaging: На микроскоп Если вы хотите, чтобы изображение на короткий период времени только в одном или двух решений, вы можете имиджа вашей ткани на стекле. В этом случае, подготовить слайд первый слой поверхности с Sylgard используя инструкции производителя. Место 20 мкл HL3 в середине слайда. Транспорт ваш расчлененный ткани еще в 20 мкл HL3 к слайду. Ткани НИКОГДА не должен подвергаться воздействию воздуха. Кроме того, любой стресс или напряжение от обработки пипетки или напряжение поверхности раствора следует избегать. Для живого изображения, ткань должна быть прочно закреплен с минимальной обработкой и контакта. Мы надежно позиции мозга с помощью воды полимеризации хирургических GluShield клея применяются через микроэлектрод, техника широко используется для эмбрионального подготовки к электрофизиологии 5. Получить стеклянного электрода как и потянул за электрофизиологических записей. Отломить наконечник и заполнить заканчиваются GluShield использованием отрицательного давления воздуха порожденных рот. Отломить только достаточно электрода, что клей может ввести. Теперь с помощью положительного давления в нанесите небольшое количество клея, чтобы Sylgard под капли HL3. Теперь, быстро установить ткани на клей, поддержания желаемой ориентации для живого изображения. Воды погружения линз теперь может быть использована для работы с изображениями. Если вы хотите добавить краситель мембрана проницаема, вы можете добавить его в ванну в то время как изображения. Мы используем Резонансное Сканирование конфокальной микроскопии, который позволяет быстро изображений с пониженным фотообесцвечивания. 6 для работы с изображениями в течение длительного периода времени или для обмена решениями полностью или несколько раз, мы используем перфузии камеры (Harvard IC30 конфокальной микроскопии камеры), который подключается к перистальтического насоса , который медленно perfuses культура решение по живой ткани (рис. 2). Движение жидкости постоянной обмена и минимальный контакт GluShield уменьшить сжатие ткани, которая наблюдалась в течение длительных периодов времени 7. Заметим, что для визуализации развития периодов времени, глаз-мозг диск комплекса должна остаться неповрежденной и должна иметь минимальный контакт с клеем. Используйте покровным стеклом покрытые капли Sylgard то есть бритая, чтобы сделать его тонким и плоским. Внесите 20 мкл HL3 на центр покровное и клей живой ткани на Sylgard. Создание прокладку, которая позволит пузырьки проходят через камеру, не подвергая живой ткани в воздух (рис. 2б). Прокладка должна быть достаточно толстой, чтобы избежать дробления тонкой ткани, но достаточно, чтобы ткани близко к конфокальной линзы микроскопа, мы используем 250 мкм в нашей установки. Соберите перфузии камеру, стараясь держать ткань полностью погружен во все времена. Начало перфузии первоначально со скоростью, близкой к 100 мкл в минуту с использованием перистальтического насоса. Эта скорость довольно быстро в зависимости от толщины прокладки который определяет высота камеры. Для визуализации в масштабе часов, вам может понадобиться добавить 20-гидроксиэкдизон и антибиотиков, но не противогрибковым, а также выполнять перфузии при гораздо более низких скоростях около 10 мкл в минуту. Наконец, мы пузырь кислорода в культуральной среде, которая поставляет перфузии камеры. 7. Представитель Результаты: В конце нашего видео протокола мы показываем пример для живого изображения в развивающихся фоторецепторных клеток с использованием подготовке представлены в разделе 5. Этот препарат пользуется дрозофилы трансгенез к клетке-специально выразить флуоресцентные журналистам. В приведенном примере двух флуоресцентных репортеры выразили под контролем фоторецепторов конкретных GMR-Gal4 водитель 8: мембрана с метками myrRFP и эндосом маркер 2xFYVE-GFP 9. Двухканальный 3D наборов данных с ограничительной рамки 70x70x17.5μm и воксела размером 137x137x700nm (512x512x26) были получены каждые 1 мин. В фильме показана выбранной плоскости с течением времени в этом наборе данных 4D, который показывает динамику внутриклеточных эндосом торговли людьми и событиями пузырьков синтеза. Представитель изображения для фиксированных препаратах тканей глаза и пластинки, показаны на рис. 3.