Direkte Starten eines Replication Fork von einem Head-On RNA Polymerase Stalled

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet Pomerantz und O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010) . 1. Montage eines gestoppt RNAP Dehnung Komplex wurde wie folgt durchgeführt: 500 nM Endkonzentration von E. coli RNAP σ 70 hat er wurde mit 5 nM Endkonzentration von einem biotinylierten 3,6 kb DNA-Template enthalten, die T7A1 Promoter in 100 ul Puffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 gemischt mM DTT, 10% Glycerin) für 10 min bei 37 ° C. 100 uM der APU und 40 uM jedes GTP, ATP und CTP wurden für weitere 10 min bei 37 ° C aufgenommen 2. Immobilisierung des gestoppt RNAP Dehnung Komplexes auf Streptavidinbeads wurde wie folgt durchgeführt: 200 ul Streptavidin-Magnetpartikel Kügelchen (Invitrogen) wurden, um die Reaktion über 10 min bei Raumtemperatur aufgenommen. 3. Die Reinigung der immobilisierten gestoppt RNAP Dehnung Komplex wurde wie folgt durchgeführt: Die Perlen (von oben) wurden 5 mal mit 0,9 ml Puffer A mit 0,75 M NaCl, 200 ug / ml Heparin und 20 pg / ml ssDNA (Der Überstand wurde nach jedem Waschschritt durch magnetische Separation entfernt.) Anschließend die gewaschenen Perlen wurden 2 mal mit 0,9 ml Puffer A gewaschen 4. Die Bildung einer Replikationsgabel stromabwärts bezüglich der Kopf-an RNAP wurde wie folgt durchgeführt: Die Perlen (von oben) wurden in 100 ul New England Biolabs Puffer 4 und 10 Einheiten von Sap I (New England Biolabs) resuspendiert wurde für 10 min bei 37 ° C. Die Perlen wurden 3 mal mit 0,9 ml Puffer A gewaschen und dann in 50 ul von Quick T4 Ligationsreaktion Puffer (New England Biolabs) resuspendiert. 2 ul von Quick T4-Ligase (New England Biolabs) wurde zusammen mit 6 nM Endkonzentration von pre-geglüht gespaltene DNA (RP10, RP22, RP25) für 10 min bei Raumtemperatur aufgenommen. Die Perlen wurden 3 mal mit 0,9 ml Puffer A gewaschen 5. Versammlung der replisome und Initiierung von führenden Strang-Synthese an der Replikationsgabel wurde wie folgt durchgeführt: 448 pmol der DnaB (als Hexamer) wurde mit den Beads 150 ul Puffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% Glycerin) für 30 s bei 23 ° C. 4,9 pmol des Pol III * (Pol III HE minus β), 15 pmol von β, 2 mM ATP und 60 uM dGTP und dATP wurden auf ein Volumen von 200 ul zugegeben und weitere 5 min bei 37 ° C. Replication wurde nach Zugabe von 10 pg SSB und 24 uM dATP und dTTP mit initiiert [α-32 P] dTTP und [α-32 P] dCTP (spezifische Aktivität, 3000-5000 cpm / pmol) auf ein Endvolumen von 250 ul. Die Reaktionen wurden nach 10 min nach Zugabe von 12 ul 500 mM EDTA beendet. 6. Reinigung und Konzentrierung der radioaktiv markierten DNA-Produkte wurde wie folgt durchgeführt: Die Perlen (von oben) gekocht wurden nach der Reaktion wurde beendet, um die DNA aus den Perlen zu entfernen. Ein verbleibender DNA übrigen an der Perlen wurde durch die Behandlung der Perlen mit Proteinase K in einem Volumen von 10 ul für 30 min bei 50 ° C entfernt Die Perlen wurden dann gekocht und der Überstand wurde durch magnetische Separation entfernt. Der kombinierte Überstand, der die DNA wurde unter Verwendung des Qiagen PCR Cleanup Kit. Gereinigtes radioaktiv markierten DNA-Produkte wurden dann in einem alkalischen Agarosegel analysiert. * Replication in der Abwesenheit von einem Kopf-an RNAP gestoppt Dehnung komplex wie oben ausgeführt wurde, aber σ 70 wurde weggelassen. Repräsentative Ergebnisse: Collision der replisome mit einem Kopf-an RNAP führt in der Regel zwei Produkten von 2,5 kb und 3,6 kb Länge. Die 2,5 kb Produkt ist die Länge der DNA aus der Gabel, die gestoppt RNAP und Ergebnisse aus replisome Abwürgen beim Zusammenstoß mit der RNAP. Das 3,6 kb Produkt stellen in voller Länge DNA und Ergebnisse aus entweder unvollständig Belegung des Promotors durch RNAP oder teilweise replisome Durchlesen durch den Kopf-an RNAP. Ein gutes oder genaues Ergebnis zeigt, dass ca. 50% in voller Länge DNA hergestellt wird. Doch in einigen Fällen weniger Belegung des Promotors durch RNAP auftritt und einen höheren Prozentsatz von Volllängen-DNA ist, da eine größere Population von replisomes beobachtet nicht begegnen einem Kopf-an RNAP. Replikation in Abwesenheit eines gestoppt RNAP Ergebnisse in nur voller Länge DNA (3,6 kb). Abbildung. 1 Die replisome wird von einem Kopf-an RNAP behindert. (A) Versuchsaufbau. A E. coli RNAP gestoppt Dehnung Komplex auf einem biotinylierten DNA mit den T7A1 Promoter wie zuvor beschrieben (9) montiert wurde. Kurz gesagt wurde ein Stillstand Dehnung Komplex 20 bps stromabwärts vom Promotor durch Inkubation RNAP-Holoenzym mit biotinylierten DNA für 10 min durch Zugabe von APU, GTP, ATP und CTP für weitere 10 min, gefolgt gebildet. Streptavidin Beads wurden für weitere 10 min dann die Kügelchen wurden fünfmal mit je 0,9 ml Puffer mit 0,75 M NaCl, 200 mg / ml Heparin und 100 nM Einzelstrang-DNA zu instabilen RNAP-DNA-Komplexe und überschüssige NTPs entfernen hinzugefügt . Die DNA wurde dann mit SAPI verdaut, gewaschen und ligiert, um ein Pre-geglüht gespaltene DNA. Die Perlen wurden erneut vor der Montage des replisome gewaschen. Der Veranstalter ist 2,5 kb aus der Gabel liegt und orientiert sich an die Transkription auf die Gabel. (B) DnaB wurde hinzugefügt, dann replisome montiert wurde und die Replikation wurde entweder in der Gegenwart begonnen werden (Spur 2) oder Abwesenheit (Spur 1) eines Kopf-an RNAP.