Reinicie direta de um garfo de replicação travado por uma RNA polimerase Head-On

Este método foi utilizado na pesquisa, publicada na Pomerantz e O'Donnell, Ciência 327, 590-592 (2010) . 1. Montagem de um complexo parou RNAP alongamento foi realizado da seguinte forma: 500 nM concentração final de E. RNAP coli σ 70 HE foi misturado com 5 nM concentração final de um modelo de DNA biotinilado 3,6 kb contendo o promotor T7A1 em 100 l de tampão A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, glicerol 10%) por 10 min a 37 ° C. 100 mM de Apu e 40 mM cada um GTP, ATP e CTP foram adicionados para um adicional de 10 min a 37 ° C. 2. Imobilização do complexo parou RNAP alongamento em gotas de estreptavidina foi realizada da seguinte forma: 200 mL de estreptavidina magnético revestido contas (Invitrogen) foram adicionados à reação acima de 10 min em temperatura ambiente. 3. Purificação do complexo alongamento imobilizado parado RNAP foi realizada da seguinte forma: As contas (de cima) foram lavadas 5 vezes com 0,9 ml de tampão contendo 0,75 M A NaCl, 200 mcg / ml de heparina e 20 mg / ml ssDNA (O sobrenadante foi removido após cada etapa de lavagem por separação magnética.) Em seguida, o pérolas foram lavadas duas vezes com 0,9 ml de tampão A. 4. Formação de um garfo de replicação a jusante em relação à cabeça-on RNAP foi realizada da seguinte forma: As contas (de cima) foram ressuspensos em 100 ml de New England Biolabs buffer de 4 e 10 unidades de Sap I (New England Biolabs) foi adicionado por 10 min a 37 ° C. As pérolas foram lavadas três vezes com 0,9 ml de tampão A e, em seguida, ressuspendido em 50 ul de tampão de reação T4 Ligadura rápida (New England Biolabs). 2 l da ligase T4 rápida (New England Biolabs) foi adicionado, juntamente com 6 nM concentração final de pré-recozido DNA bifurcada (RP10, RP22, Rp25) por 10 min em temperatura ambiente. As pérolas foram lavadas três vezes com 0,9 ml de tampão A. 5. Assembleia da replissoma e iniciação da síntese vertente líder na bifurcação de replicação foi realizada da seguinte forma: 448 pmol de DnaB (como hexâmero) foi incubada com as 150 contas mL de tampão A (20 mM Tris glicerol-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) durante 30 s em 23 ° C. 4,9 pmol de Pol III * (Pol III HE menos β), 15 pmol de β, 2 mM ATP, e 60 mM de cada dATP dGTP e foram adicionados a um volume de 200 mL e incubadas mais 5 minutos a 37 ° C. Replicação foi iniciada após a adição de 10 mg e 24 mM SSB cada um dATP e dTTP, juntamente com [α-32 P] dTTP e [α-32 P] dCTP (atividade específica, 3.000-5.000 cpm / pmol) para um volume final de 250 mL. Reações foram encerradas depois de 10 min após a adição de 12 mL de 500 mM EDTA. 6. Purificação e concentração do rádio produtos com etiqueta de DNA foi realizada da seguinte forma: As contas (de cima) foram cozidos após a reação foi encerrado, a fim de remover o DNA dos grânulos. Qualquer DNA residual continuem ligadas às esferas foi removido por tratar as contas com proteinase K em um volume de 10 ul por 30 min a 50 ° C. As contas eram então cozidos eo sobrenadante foi removido por separação magnética. O sobrenadante combinada contendo o DNA foi purificado usando o kit Qiagen Limpeza de PCR. Purificada rádio produtos com etiqueta de DNA foram então analisados ​​em gel de agarose alcalina. * Replicação na ausência de uma cabeça-on RNAP parou complexo de alongamento foi realizada como acima, no entanto, σ 70 foi omitido. Resultados representativos: Colisão do replissoma com uma cabeça-on RNAP geralmente resulta em dois produtos de 2,5 kb e 3,6 kb de comprimento. De 2,5 kb produto representa o comprimento do DNA do garfo à RNAP interrompido e os resultados de replissoma parando em cima de colisão com a RNAP. O produto 3,6 kb representam full-length do DNA e os resultados a partir de qualquer ocupação incompleta do promotor pela RNAP ou parcial replissoma leitura através da RNAP de frente. Um resultado bom ou precisa demonstra que aproximadamente 50% do DNA de longa-metragem é produzido. No entanto, em alguns casos, menos de ocupação do promotor por RNAP e ocorre uma maior porcentagem de full-length do DNA é observado desde uma maior população de replisomes não encontrar um RNAP de frente. Replicação, na ausência de um resultado RNAP interrompido em DNA de corpo inteiro apenas (3,6 kb). Figura. 1 O replissoma é impedido por uma RNAP de frente. (A) de instalação Experimental. A E. coli RNAP complexo alongamento parado foi montado em um DNA biotinilado contendo o promotor T7A1 como descrito anteriormente (9). Resumidamente, um complexo de alongamento parado foi formado 20 bps a jusante do promotor, incubando holoenzima RNAP com DNA biotinilado por 10 min seguido pela adição de Apu, GTP, ATP, CTP e de um mais 10 min. Contas estreptavidina foram adicionados para um adicional de 10 min, em seguida, as contas foram lavadas cinco vezes cada um com 0,9 ml de solução tampão com 0,75 m de NaCl, 200 heparina mg / ml, e 100 nM vertente único DNA para remover instável RNAP DNA complexos e excesso de PNT . O DNA foi então digerido com SAPI, lavado, e ligados a um DNA pré-recozido bifurcada. As pérolas foram lavadas novamente antes da montagem do replissoma. O promotor está localizado 2,5 kb do garfo e é orientado para a transcrição direta para o garfo. (B) DnaB foi adicionado então a replissoma foi montado e replicação foi iniciada tanto na presença (pista 2) ou ausência (pista 1) de um cabeça-on RNAP.