Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

1. Beispiel Protein Preparation In einem 500 ul Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren Sie die folgenden: Reagens Volume hinzuzufügen: * Protein-Probe (bis zu 1 mg) Bis zu 112 ul Sample Buffer (5fach) in Einbausatz zur Verfügung gestellt 30 ul DTT 1M 8μL 18 Ω H 2 O x ul auf insgesamt Probenvolumen von 150 &mgr; l ** Denaturieren die Proben bei 95 ° C für 5 Minuten. Auf Raumtemperatur abkühlen. * Die Gesamtmenge an Protein zu trennen sein wird von der Komplexität der Probe ab. Für komplexere Proben, wie Gewebehomogenat, ist 150-200 g pro Kanal empfohlen. ** Wenn das Probenvolumen weniger als 112 ul ist, hinzufügen seit 18 Ω H 2 O zu einem Endvolumen von 150 ul zu bringen. 2. Lädt die GELFREE Cartridge Entfernen Sie die GELFREE 8100 Cartridge aus dem Folienbeutel. Entfernen und Entsorgen der Abklebefolie. Entfernen Sie die Speicher-Puffer aus der Kartusche Fächer mit einer Pipette. Wenn alle 8 Kammern der Kartusche verwendet wird, kann die Patrone invertiert, um die Speicher-Puffer aus den Fächern abzulassen. Bereiten Sie die Patrone für das Laden, indem GELFREE Laufpuffer zu jedem der Patrone Kammern wie folgt: GELFREE Patroneraumes Volumen der GELFREE Laufpuffer hinzufügen Anode Pufferspeicher 8 mL Cathode Pufferspeicher 6 mL Sammelkammern 100 ul jeder Entfernen Sie alle Puffer aus der Probe Füllraum. Laden Sie die 150 ul Proben in die Be-Kammern mit einem 8-Kanal-Pipette. Legen Sie das geladene Patrone in den GELFREE 8100 Fraktionierung Station. Senken Sie die Elektroden-Arrays und den Deckel schließen. 3. Laufen Sie die Patrone Mit dem Instrument s-Touchscreen-Display, drücken Sie die Methode, um die Liste der vorprogrammierten Methoden zu sehen. Jeder der vorprogrammierten Methoden besteht aus festgelegten Spannungen und zeitbasierte Pausen entwickelt, um Proteine ​​in einem bestimmten Bereich von Molekulargewichten zu lösen. Die GELFREE 8100 wird automatisch Pause für Fraktionssammlung in den Abständen in der angegebenen Methode. Sobald die geeignete Methode identifiziert worden ist, drücken Sie die Taste abrufen, und geben Sie die Nummer des gewünschten vorprogrammierten Verfahren unter Verwendung der On-Screen-Tastatur. Drücken Sie OK, drücken Sie die Schaltfläche Übernehmen. Die Methode, die angewendet hat, wird am unteren Rand des Haupt-Bildschirm. So wählen Sie die Kanäle (Anzahl der Proben), die im Vorfeld eingesetzt werden, drücken Sie die Kanal-Taste auf dem Hauptbildschirm. So wählen Sie alle acht Kanäle wählen, drücken Sie alle. Drücken Sie dann getan werden, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Stellen Sie sicher, dass die Sicherheit Deckel geschlossen ist und dass die LED-Anzeige befindet sich am unteren Rand des Bildschirms grün. Zu Beginn der Protein-Trennung, den Startknopf drücken. Die Fraktionierung Station wird automatisch unterbrochen, wenn es Zeit Fraktionen Hinweis sammeln:. Während das System läuft, zeigen die Kreise in der Box auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt den Status der einzelnen Kanäle. Ein grüner Kreis bedeutet, dass der Kanal aktiv ist, zeigt ein gelber Kreis, dass das Gerät angehalten wurde, und ein roter Kreis zeigt an, dass der Kanal ist ausgefallen. Die angelegten Spannungen und Ströme sind auf der rechten Seite des Kanals Status Kreise dargestellt. Fraktionen sollten nur entfernt, wenn der Status Kreise gedreht haben gelbe und eine Text-Alarm erscheint auf dem Instrument s Bildschirm. Zum Entfernen Fraktionen, öffnen Sie den Deckel des Gerätes und die Verwendung einer 8-Kanal Pipette zu 150 ul aus jeder der Sammelkammern zurückzutreten. Nachdem die Fraktionen entfernt worden sind, waschen Sie die Sammelkammer zweimal mit GELFREE Laufpuffer durch Zugabe von 100 ul pro Kanal und Auf-und Abpipettieren zweimal. Nach dem Waschen, fügen Sie 100 ul der GELFREE Laufpuffer zurück in die Sammlung Kammern, den Deckel schließen, und drücken Sie die Wiederaufnahme-Taste. Die GELFREE 8100 wird bis zum nächsten Zeitintervall ausgeführt werden. Die gesamte verbleibende Zeit in das Experiment auf der rechten Seite des Bildschirms gezeigt. Um zwischen verbleibende Zeit wechseln, verstrichene Zeit, und Zeit zu pausieren, drücken Sie die Taste über der Box Anzeigedauer einstellen. Sobald alle Fraktionen wurden collected, können sie sofort zur Weiterverarbeitung Vorbereitung, wie isoelektrische Fokussierung oder Gel-Elektrophorese, oder für die Analyse mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie oder Immunaffinitäts verwendet werden. 4. Repräsentative Ergebnisse A 200 ug Rinderleber Homogenat wurde in 12 Fraktionen zu je partitioniert, mit dem GELFREE Fraktionierung System. 6 &mgr; l jeder Fraktion wurde auf einem Standard-1D-SDS-PAGE-Gel und Silber gefärbt laufen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde die Proteinprobe fraktioniert in 12 verschiedene Fraktionen, überspannt den Molekulargewichtsbereich von 3.5kDa zu 150kDa. Ein Molekulargewicht-Standard (ColorBurst, Sigma) werden auch in den Spuren 1 und 14 dargestellt. Das Gel hier gezeigten Highlights der High-Recovery Rate erreicht mit dem GELFREE 8100 für Protein-Fraktionierung. Das Gel hier gezeigten stellt 4% des Proteins aus 200 ug erholt. Abbildung 1. Proteine ​​aus Rinderleber Homogenat getrennt mit dem GELFREE Fraktionierung System. 6 &mgr; l je 150 ul Bruchteil geladen wurde und auf einem 1D-SDS-PAGE-Gel und Silber gefärbt. Ein Molekulargewicht (MW)-Standard wurde ebenfalls geladen, wie angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.