Captura Primer Extensão: Recuperação Sequence alvejado a partir de Fontes de DNA altamente degradadas

Este método foi utilizado na pesquisa relatada em Briggs et al. Ciência 325 (5938). 318-321 (2009) . Reagentes necessários: AmpliTaq Polimerase DNA de Ouro 10x GeneAmp PCR buffer II MgCl 2 25mM dNTP mix, 25 mM de cada BSA, 10 mg ml-1 em água Água de biologia molecular grau EB buffer (fornecido com MinElute kit de purificação PCR), 10 mM Tris HCl, pH 8,5 MinElute Kit de Purificação PCR M-270 estreptavidina Dynabeads 2x Encadernação e Wash (BW) tampão (2 M NaCl, 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,2% Tween 20) 1x Encadernação e Tampão de lavagem (BW) (2x tampão 2X BindWash diluída em água) Hot Wash (HW) buffer (2.5mm MgCl, 1X tampão Taq ouro, 0,1% Tween 20) Para informações sobre o fabricante quanto fora do padrão de reagentes e equipamentos mais tarde tabela. 1) ampliação da Biblioteca O modelo de DNA aqui é uma biblioteca de 454 preparados a partir de uma baixa fonte de DNA no número de cópias conforme descrito em (Rohland e Hofreiter, 2007a, 2007b) e (Maricic e Pääbo, 2009). Para amplificar toda a biblioteca, prepare a mistura PCR seguinte: Reagente mL por reação Água 45 10X Gene Amp PCR buffer II 10 MgCl 2 (25mM) 10 BSA (10 mg / ml) 2 dNTPs (25 mM cada) 1 454 emPCR fwd primer/10uM 3 454 emPCR primer/10uM rvs 3 AmpliTaq DNA polimerase Gold (5 U / mL) 1 454 modelo de biblioteca de DNA 25 Total 100 Use o programa de PCR a seguir em um cycler Thermo por 14 ciclos de amplificação 95 ° C 12min 95 ° C 30 60 ° C (temperatura de recozimento ou desejado) 1 min 72 ° C 1 min Ir para 2 (x 13) 72 ° C 5min 10 ° C ∞ Purificar a reação sobre uma coluna de spin Qiagen MinElute acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 50 mL tampão EB. Quantificar o produto purificado amplificado, bem como uma alíquota da biblioteca sem amplificação com qPCR (Meyer et al., 2007). Se o produto amplificado tem mais de 1 X 10 12 cópias por ul, reduzir a quantidade de modelo na etapa seguinte Primer Extension para garantir que não mais de 2 X 10 12 cópias são adicionados à reação de extensão Primer. 2) Extensão Primer Prepare uma mistura mestre para o número necessário de reações. Reagente mL por reação Água 45 10X Gene Amp PCR buffer II 10 MgCl 2 (25mM) 10 BSA (10 mg / ml) 2 dNTPs (25 mM cada) 1 454 emPCR fwd primer/10uM 3 454 emPCR primer/10uM rvs 3 AmpliTaq DNA polimerase Gold (5 U / mL) 1 454 modelo de biblioteca de DNA 25 Total 100 Executar o programa a seguir em um Termociclador para a reação única cartilha extensão: 95 ° C 12min 60 ° C (ou a sua cartilha PEC annealing temporário se for diferente) 1 min 72 ° C 5 min 72 ° C para sempre! Etapa crítica Mantenha reação após a extensão a 72 ° C. Em seguida, diretamente ou pipeta 150ul PBI PB buffer para QIAGEN purificação MinElute nos tubos antes de remover a partir do bloco de calor. Isto é importante para evitar a não-específicas de primer recozimento e captura como a mistura esfriar. Purificar a reação sobre uma coluna de spin Qiagen MinElute, de acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 50 mL EB. 3) Captura de Produto Extensão Ressuspender solução estoque de M-270 contas em vortex. Retire 25 mL de suspensão talão por amostra. Lave as contas duas vezes com 500ul 2x BW buffer e ressuspender em 25 mL de buffer 2xBW por amostra. Adicionar 25 mL de eluato passo 2,3-25 mL suspensão talão do passo 3.1. Misture em seguida, gire para 15 min à temperatura ambiente. Recomendações: manter restantes 5 ul do eluato a partir do passo 2.3 para quantificação qPCR. Transfira a mistura toda para um novo tubo de 1,5 ml (o que ajuda a diminuir as transferências de fragmentos não-alvo da biblioteca). Pellet sobrenadante usando o coletor de partículas magnéticas (MPC) e desprezar o sobrenadante. Lavar 5 vezes com 500 mL de buffer 1xBW (muitas lavagens ajudar a remover como pano de fundo tanto quanto possível). Após a etapa de lavagem passado, girar rapidamente e remover os últimos vestígios do sobrenadante. Adicionar 500μl 1x Hot Tampão de lavagem (HW). Agitar durante 2 min a 65 ° C (ou 5C acima da cartilha PEC Tm) em um bloco térmico. Retire o sobrenadante rapidamente após isso, para minimizar a arrefecer. (Este passo é para remover fragmentos de fundo ainda associados com o PEC primers, mas não realmente estendido no durante a etapa de extensão). Remove os últimos vestígios do sobrenadante. Ressuspender o sedimento talão em 30 mL tampão EB. Transfira a mistura toda para um novo tubo de 1,5 ml (o que ajuda a diminuir as transferências de fragmentos não-alvo da biblioteca). Incubar a 95 ° C por 3 minutos em um termociclador para a eluição. Lugar no MPC e remover o sobrenadante, tomando cuidado para deixar as contas para trás. 4) Captura de amplificação Produto Prepare uma mistura mestre PCR para o número necessário de amostras. Reagente mL por reação Água 45 10X Gene Amp PCR buffer II 10 MgCl 2 (25mM) 10 BSA (10 mg / ml) 2 dNTPs (25 mM cada) 1 454 emPCR fwd primer/10uM 3 454 emPCR primer/10uM rvs 3 AmpliTaq DNA polimerase Gold (5 U / mL) 1 Produto de captura eluída 25 Total 100 Use o programa de PCR a seguir em um cycler Thermo por 14 ciclos de amplificação: 95 ° C 12min 95 ° C 30 60 ° C (temperatura de recozimento ou desejado) 1 min 72 ° C 1 min Ir para 2 (x 13) 72 ° C 5min 10 ° C ∞ Purificar a reação sobre uma coluna de spin Qiagen MinElute sílica de acordo com as instruções do fabricante. Eluir em 50 mL tampão EB. O produto pode ser usado agora, quer para uma segunda rodada de captação, começando no passo 2.1, ou entrou directamente para o 454 emulsão PCR protocolo, para o seqüenciamento. Resultados representativos: É altamente recomendável quando se inicia com o protocolo PEC para realizar uma reação de captura de primeira, onde uma pequena quantidade de uma "seqüência alvo de controlo positivo" (por exemplo, um produto da PCR ~ 100bp – 1 picograma é facilmente suficiente) é misturado com o normal recomendado quantidade de amplificado 454 modelo de biblioteca (veja o passo 2.1), e captura é feita com um primer PEC único projetado para capturar o produto controle positivo. Se essa reação controle é realizado qPCR, com tanto positivos específicos de controle e 454 adaptador específico pares de primers podem ser usados ​​para quantificar a quantidade de 'target controle' versus fundo na reação purificada cartilha de extensão (1,3), produto de extensão de primer (2,3 ) e produto de captura eluída talão (3.6). Desta forma, tanto a eficácia da remoção de fundo ("especificidade") ea eficiência de recuperação de destino ("sensibilidade") em suas condições experimentais podem ser medidos diretamente. A bem sucedida PEC protocolo normalmente tem as seguintes propriedades – Sensibilidade (medido pela quantidade de alvo de controle mantidos através do protocolo): Montante total da meta de controle em produto de captura eluída talão (3.6) = ~ 10-20% do valor total em purificada reação de extensão de primer (2.3). Fundo (medido pelo par de primer emPCR 454): Montante total do fundo em produto de captura eluída talão (3.6) <0,01% do montante total em reação purificada cartilha de extensão (2,3). Se houver menos de 1% da meta remanescentes no produto final, a etapa de extensão de primer pode ter sido mal sucedido e deve ser investigada. Se há muito mais do que 0,01% do fundo restantes nos produtos finais, os passos de lavagem pode ter sido incorrectamente realizada e deve ser investigada.